论文摘要
研究背景乙型肝炎病毒（hepatitis B virus HBV）感染在我国较为常见,并可引发乙型肝炎病毒相关性肾炎（hepatitis B virus associated glomerolunephritis,HBVGN）。HBVGN临床常表现为肾病综合征,其病理改变类型多样,以不典型膜性肾病最常见。HBVGN的发病机制尚不十分清楚,目前主要有三种学说:HBV免疫复合物致病、HBV感染导致的免疫功能失调和病毒直接感染致病学说,其中前两种已被大多数学者接受。近年研究发现:HBVGN肾小球及肾小管上皮细胞中存在HBV相关抗原表达及HBV病毒复制;肾小球内存在HBV的完整病毒颗粒,甚至管状网状包涵体;肾小管中HBV-DNA的存在影响蛋白尿的程度和持续时间,这些均提示HBV在HBVGN的发生中可能具有直接作用。但目前对于HBV病毒直接感染致病学说仍缺乏相关的实验依据。核转录因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）是一种具有多向调节作用的核转录因子,在细胞信号传递和诱导某些基因表达过程中起重要作用。细胞静息时,NF-κB二聚体与其抑制因子（inhibitor of nuclear factor-kappa B,IκB）结合以无活性形式存在于细胞质中,多种因素可引起NF-κB/IκB复合物解离,NF-κB活化、易位入核后与靶基因调控区的κB基序结合调节其转录过程,可参与多种炎症性细胞因子和趋化因子的产生、成纤维细胞的增生分化、细胞外基质交联及细胞凋亡等过程。近年研究表明NF-κB的过度活化与肾脏疾病的关系密切,参与肾脏的炎症性损害。肝脏研究发现,第194～76位氨基酸截短的表面抗原中蛋白（c-terminally truncated middle size surface proteins,MHBst）和乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）均具有反式激活作用,能够激活某些转录因子（如NF-κB、AP-1）,使其核易位、反式激活相关基因表达引起炎症、凋亡等过程。尽管目前机制仍不十分清楚,但有研究发现MHBst、HBx激活NF-κB可能与蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）和Raf/ERK通路的激活有关。本课题组在既往研究中首次发现在HBVGN肾组织（尤其是肾小管上皮细胞）中存在NF-κB蛋白的核易位。那么,在肾组织中,NF-κB蛋白的激活是否也与MHBst167、HBx有关其具体机制又是如何NF-κB蛋白的激活对肾脏细胞有何影响上述研究,国内外尚未见文献报道,而该问题的阐明将为HBVGN的病毒直接致病机制提供部分实验依据。研究目的1,研究MHBst167、HBx对NF-κB蛋白的活化、肾小管上皮细胞凋亡的影响。2,在肾小管上皮细胞中初步探讨MHBst167、HBx激活NF-κB蛋白的机制。实验方法1,利用PCR法分别从p1.2I（IHBV,adr血清型）质粒中扩增特异的MHBst167和HBx片断,构建pcDNA3.1（+）MHBst167和pcDNA3.1（+）HBx载体。2,MHBst167或/和HBx瞬时转染人类近端肾小管上皮细胞HK-2后,通过免疫细胞化学、Western blot和EMSA法检测NF-κB蛋白活化的变化。实验中同时设立NF-κB抑制剂PDTC（30μM）处理的对照组。3,MHBst167或/和HBx瞬时转染HK-2细胞后（经或不经PDTC处理）,Hochest33258染色检测细胞凋亡率,并与NF-κB活化程度做相关性分析。4,初步探讨在HK-2细胞中MHBst167/HBx引起NF-κB蛋白活化的机制:（1）构建pGL3-p-（κB）5报告基因载体,双萤光素酶分析法检测MHBst167或/和HBx对κB调控基因转录的影响（包括对NF-κB自身的调节）;（2） MHBst167或/和HBx瞬时转染HK-2细胞后（经或不经PKC抑制剂G 6983处理）,通过PKC激酶活性检测、免疫沉淀法和Western blot法分析MHBst167/HBx对PKC/Raf/ERK通路的影响及其与NF-κB活化的关系。实验结果1,成功构建pcDNA3.1（+）MHBst167、pcDNA3.1（+）HBx真核表达载体:测序结果分别与HBV病毒基因组序列AF052576.1和AY123424.1一致。2,瞬时转染MHBst167或/和HBx后,HK-2细胞NF-κB蛋白核易位增多、磷酸化IκBα蛋白表达增加:（1）免疫细胞化学结果显示:MHBst167、HBx和MHBst167+HBx组的NF-κBp65细胞核阳性率分别为12.58%±0.543%、22%±0.477%和30.76%±0.49%,较pcDNA3.1（+）空载体转染组明显增加（P<0.05）,且MHBst167+HBx共转染组较MHBst167、HBx单一基因转染组增加显著（P<0.05）,PDTC处理后,各转染组NF-κBp65胞核阳性率显著减少（P<0.05）。（2） Western blot结果显示:a) MHBst167、HBx及MHBst167+HBx组的细胞核内NF-κBp65蛋白表达量增加,分别为空载体转染组的1.8倍、1.9倍和2.1倍,胞质中NF-κBp65和NF-κBp50蛋白的表达分别是空载体转染组的1.9～2.9倍,其表达均较空载体组明显增加（P<0.05）;且胞核和胞质的NF-κB蛋白表达在MHBst167+HBx共转染组均较MHBst167、HBx单一基因转染组增加明显（P<0.05）,经PDTC处理后各组的NF-κB蛋白表达均减少（P<0.05）。b) MHBst167、HBx及MHBst167+HBx组的细胞总蛋白的IκBα蛋白表达在各转染组之间无显著性差异（P>0.05）,经PDTC处理后各组的IκBα蛋白表达略增加;总蛋白中磷酸化IκBα蛋白表达增加（P<0.05）,分别是空载体转染组的1.44倍、1.52倍和2.03倍（P<0.05）,MHBst167+HBx共转染组较MHBst167、HBx单一基因转染组增加显著（P<0.05）,各转染组均能被PDTC所抑制（P<0.05）;总蛋白同样显示NF-κBp65和NF-κBp50蛋白表达增加（P<0.05）,且MHBst167+HBx共转染组较MHBst167、HBx单一基因转染组增加显著（P<0.05）,各组均能被PDTC所抑制（P<0.05）。3,瞬时转染MHBst167或/和HBx后HK-2细胞核内κB位点结合活性增强:MHBst167、HBx及MHBst167+HBx组的细胞核内κB-蛋白复合物滞后带增加,分别是空载体组的1.7倍、3.4倍和5.9倍（P<0.05）,MHBst167+HBx共转染组较MHBst167、HBx单一基因转染组增加显著（P<0.05）;PDTC处理可以有效抑制其结合活性（P<0.05）。4,瞬时转染MHBst167或/和HBx后HK-2细胞凋亡率增加:MHBst167、HBx及MHBst167+HBx组的细胞凋亡率分别为8.18%、10.23%和13.98%,较空载体组（3.17%）显著增加（P<0.05）,且MHBst167+HBx共转染组较MHBst167、HBx单一基因转染组增加明显（P<0.05）;各转染组经PDTC处理后凋亡率均有所减少（P<0.05）。相关性分析显示,转染后HK-2细胞的凋亡率与细胞核内NF-κBp65表达（r=0.841,P<0.05）、κB-蛋白结合活性（r=0.894,P<0.05）呈正相关。5,瞬时转染MHBst167或/和HBx后HK-2细胞的κB调控基因转录增加:转染等量的MHBst167、HBx、MHBst167+HBx载体DNA后,各组萤光素酶活性均较空载体转染组增加（P<0.05）,其中MHBst167+HBx共转染组较MHBst167、HBx单一基因转染组增加明显（P<0.05）;且萤光素酶活性的高低与目的基因载体之间存在剂量依赖性（P<0.05）,但各转染组的萤光素酶活性在24 h和48 h之间的无显著差异（P>0.05）。PDTC处理后,各组的萤光素酶活性较非PDTC处理组显著减弱（P>0.05）。6,瞬时转染MHBst167或/和HBx对HK-2细胞PKC/Raf/ERK通路的影响:（1） MHBst167、HBx及MHBst167+HBx组的PKC激酶活性较空载体转染组增强（P<0.05）,且均能被G 6983所抑制（P<0.05）。（2） MHBst167、HBx及MHBst167+HBx组（经或不经G 6983处理）的肾小管上皮细胞HK-2内均未发现有c-raf-1-ERK复合物形成。（3） MHBst167、HBx及MHBst167+HBx组（经或不经G 6983处理）的Raf-1蛋白均表达阴性,与免疫沉淀的结果一致;各组ERK蛋白表达相对一致,组间无显著性差异（P>0.05）;NF-κBp65和磷酸化ERK蛋白均较空载体转染组表达增加（P<0.05）,MHBst167+HBx共转染组较MHBst167、HBx单一基因转染组增加显著（P<0.05）,G 6983能够抑制NF-κBp65和磷酸化ERK蛋白的表达。结论1,MHBst167、HBx转染人类近端肾小管上皮细胞HK-2后,均能活化NF-κB蛋白,表现为IκB蛋白磷酸化增加、NF-κB蛋白核易位增多、核内κB位点结合活性增强以及κB调控基因转录水平增加;NF-κB蛋白活化水平与HK-2细胞的凋亡密切相关;PDTC能够有效抑制MHBst16 7或/和HBx引起的NF-κB蛋白活化和细胞凋亡过程。2,MHBst167和HBx在活化NF-κB蛋白、引起细胞凋亡过程中存在协同作用。3,在肾小管上皮细胞中,MHBst167、HBx可能通过以下途径活化NF-κB: （1） PKC/ERK/NF-κB通路:通过增加细胞内PKC激酶活性、磷酸化ERK（非Raf依赖性）,从而活化NF-κB,使其发生核易位。（2） MHBst167、HBx通过胞质内信号途径活化NF-κB后,NF-κB还可能反式激活自身的转录、表达。
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