论文摘要
目前,空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni, C.jejuni）感染是全球范围内急性胃肠炎最常见的病因之一。更具严重后果的是该菌与格林-巴利综合征（Guillain-Barrésyndrome, GBS）有非常密切的关系,是GBS发生的重要前驱感染因素。但是,由于目前对空肠弯曲菌的遗传学特性、毒力因子、致病作用和空肠弯曲菌诱发GBS的机制尚不完全明了,至今仍缺少有效而可行措施来预防空肠弯曲菌感染引起的腹泻和GBS的发生。为此,本研究针对空肠弯曲菌,选择具有致病性、保守性、免疫原性的基因克隆入TA载体并以其为模板,通过空肠弯曲菌细胞扩张毒素cdtA、cdtB、cdtC基因的克隆、序列分析及B细胞表位预测,构建了空肠弯曲菌cdtA及其高抗原肽段的原核重组质粒和空肠弯曲菌cdtA、cdtB、cdtC真核表达重组载体,为探讨其在小鼠体内诱导特异性免疫应答的效应和在小鼠空肠弯曲菌攻击模型中的免疫保护力,以及为深入开发新型空肠弯曲菌疫苗奠定基础。课题拟按以下四部分进行:第一部分空肠弯曲菌候选疫苗基因的T-A克隆目的:选择具有致病性、保守性、免疫原性的16个CJ候选疫苗基因克隆入T载体,选择测序最佳者大提质粒为后续工作提供模板。方法:（1） 16个候选疫苗基因片段:以CJ O:19的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得16个基因DNA片段,并测序比较与标准株NCTC11168的同源性。在此基础上,使16个基因PCR纯化产物为目的基因DNA片段,分别插入pGEM-T载体,以构建T-A重组质粒。重组质粒经双酶切鉴定、PCR鉴定和DNA双向测序确认。（2）重组质粒的测序及大提:每个基因选取3-5个重组质粒经双向测序后,选取1个序列最佳者大提质粒并测其浓度。结果:（1） PCR反应显示16个基因DNA片段与预期大小一致,DNA双向测序证实CJ O:19基因序列与NCTC11168基因序列具有高度同源性。所构建的重组质粒分别经双酶切和PCR鉴定,以及DNA双向测序证实目的基因插入成功。（2）测定16个大提重组质粒浓度后稀释为1μg/μL。结论:成功构建了16个候选疫苗基因的T-A克隆。第二部分空肠弯曲菌cdtA、cdtB、cdtC基因的克隆、序列分析及B细胞表位预测目的:预测和分析空肠弯曲菌细胞扩张毒素cdtA、cdtB、cdtC蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,为CJ疫苗研制提供基础资料。方法:PCR扩增cdtA、cdtB、cdtC基因,克隆入pGEM-T载体并测序,对重组质粒测序后进行生物信息学分析。以cdtA、cdtB、cdtC基因推导的氨基酸序列为基础,采用Chou-Fasman法、Ganmier-Robson法和Karplus-Schulz法预测该蛋白二级结构;按Kyte-Doolittle方案、Emini方案和JamesonWolf方案预测其B细胞抗原表位。结果:克隆的cdtA、cdtB、cdtC基因全长分别为874bp, 913bp, 711bp。发现cdtA的840-32bp序列完全与标准株NCTC11168的1-807bp序列一致,cdtB的841-42bp序列完全与标准株NCTC11168的1-798bp序列一致,cdtC的667-96bp序列完全与标准株NCTC11168的1-570bp序列一致。CDTA第11～44和54～90区段,CDTB第5～70, 78～112, 137～187区段,CDTC第119～140和145～193区段及其附近可能是CJ-CDTABC蛋白的B细胞表位优势区。结论:成功扩增空肠弯曲菌O:19菌株cdtA、cdtB、cdtC基因,测序表明与标准株序列高度同源,已有文献证明cdtA、cdtB、cdtC基因在不同CJ菌株中高度保守,符合疫苗候选抗原的基本特征;预测出CDTA、CDTB、CDTC蛋白的B细胞抗原表位优势区,这将为CJ新型疫苗的设计和单克隆抗体的筛选等方面的研究提供重要信息。第三部分空肠弯曲菌cdtA及其高抗原肽段的原核重组质粒的构建和表达目的:空肠弯曲菌细胞扩张毒素cdtA及其高抗原肽段蛋白人工表达。方法:使用PCR方法获得cdtA、A1、A2编码的基因,经确证后将该基因克隆到谷胱甘肽转移酶融合表达载体（pGEX-5x-1）中,构建了pGEX–cdtA、cdtA1、cdtA2表达质粒,在大肠杆菌BL21中获得了相应表达。结果:pGEX–cdtA、cdtA1、cdtA2重组菌株具有明显的表达带,其分子量与预期的结果相同。结论:成功构建了cdtA及其高抗原肽段的原核表达重组质粒,并表达出相应蛋白为其免疫原性分析及研制疫苗奠定了基础。第四部分空肠弯曲菌cdtA、cdtB、cdtC真核表达重组载体的构建与表达目的:以空肠弯曲菌细胞扩张毒素cdtA、cdtB、cdtC为目的基因,构建CJ-cdtA、cdtB、cdtC基因的真核表达重组载体pcDNA3.1（+）-cdtA、pcDNA3.1（+）-cdtB、pcDNA3.1（+）-cdtC,为CJ核酸疫苗的研制提供实验材料。方法:用Primer5.0软件分析GenBank中空肠弯曲菌细胞扩张毒素cdtA、cdtB、cdtC基因序列,设计合成相应特异性引物,引入EcoR I、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,PCR扩增cdtA、cdtB、cdtC目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1（+）多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1（+）-cdtA、pcDNA3.1（+）-cdtB、pcDNA3.1（+）-cdtC;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果:扩增出特异的cdtA、cdtB、cdtC基因片段,大小约为807bp、798bp、570bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了CJ真核表达重组载体pcDNA3.1（+）-cdtA、pcDNA3.1（+）-cdtB、pcDNA3.1（+）-cdtC。结论: PCR扩增得到了大小约为807bp、798bp、570bp的CJ-cdtA、cdtB、cdtC目的基因片段;并成功构建了pcDNA3.1（+）-cdtA、cdtB、cdtC真核表达重组载体。
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