乳中乳铁蛋白检测方法的建立

论文摘要

乳铁蛋白（LF）是一种存在于哺乳动物外分泌液中的糖蛋白。它具有多种生物活性功能,如广谱抗菌活性、增强铁的传递和吸收、免疫调节作用、调节发炎反应、抗病毒作用和抑制脂肪氧化作用,可广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。本实验建立快速,准确的乳铁蛋白胶体金检测法。通过纯化LF,LF多克隆抗体的制备,胶体金方法的建立和优化等实验。初步建立起来了乳品中乳铁蛋白胶体金检测法。在实验室条件下研究了离子交换层析技术纯化LF的层析条件。选用带羧甲基的弱酸性阳离子交换CM-SepHarose Fast Flow进行动态吸附,选用质量分数为1.6%和5%的NaCl溶液进行阶跃洗脱;重复层析和对洗脱峰分别进行接样的方法,获得的LF纯度达到96.7%,浓度达到3.2mg/ml。LF多克隆抗体的制备:本实验以新西兰大白兔和高产罗曼蛋鸡为免疫对象,新西兰大白兔免疫剂量为1mg/kg,免疫周期为三周,免疫次数四次。罗曼蛋鸡免疫剂量为0.5mg/kg,免疫周期为两周。抗血清及卵黄的处理均采用饱和硫酸铵沉淀法,50%,33%两个饱和度反复沉淀。间接ELISA法测效价,抗血清为1:48000。胶体金检测LF方法的建立和优化。从检测波长,最佳金探针浓度、最佳溶液PH值、检测温度、稀释液中BSA的浓度和作用时间段六个影响因素进行探讨,得出最佳检测条件即检测波长为630nm;金探针最佳浓度为1:2;最佳PH值为7.4;稀释液中BSA的浓度为15 ug/ml;最佳检测温度为25℃;作用时间段为0-20min。以检测牛乳中的LF为例,建立起一个新的快速检测方法模式,方法评价和应用。本实验以检测牛乳中的LF为例,通过批内和批间重复性试验、回收试验、方法对比试验来评价这种检测方法。并在检测牛常乳和牛初乳中进行应用,进一步证明了此方法的可行性和实用性。结果表明:该法敏感性高,检测范围10-2500ng/ml,回收率95.89%,批内变异系数CV%=3.57%,批间CV%=4.74%。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一部分 文献综述
• 1.1 LF 综述
• 1.1.1 LF 简介
• 1.1.2 LF 结构
• 1.1.3 LF 理化性质与生物学功能
• 1.1.4 影响乳铁蛋白生物活性的因素
• 1.1.5 乳铁蛋白的应用进展
• 1.1.6 乳铁蛋白的分离方法进展
• 1.1.7 乳铁蛋白的测定方法研究进展
• 1.2 胶体金综述
• 1.2.1 胶体金的结构
• 1.2.2 胶体金的性质
• 1.2.3 免疫金标记技术的基本原理
• 1.2.4 胶体金的应用
• 1.2.5 胶体金免疫技术的优点及应用展望
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 乳铁蛋白的纯化
• 3.1.1 试剂与仪器
• 3.1.2 试验方法及优化
• 3.2 抗乳铁蛋白多克隆抗体的制备
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 牛乳铁蛋白抗原溶液浓度的测定
• 3.2.2.2 乳铁蛋白油乳苗的制备
• 3.2.2.3 抗乳铁蛋白卵黄抗体的制备
• 3.2.2.4 兔抗乳铁蛋白多克隆抗体的制备
• 3.3 乳铁蛋白检测方法的建立
• 3.3.1 金标抗 LF 抗体的制备
• 3.3.1.1 主要仪器和试剂
• 3.3.1.2 试验方法
• 3.3.2 检测方法的建立
• 3.3.2.1 主要试剂与仪器
• 3.3.2.2 试验方法
• 3.3.3 方法评价
• 3.3.3.1 试剂与仪器
• 3.3.3.2 试验方法
• 3.3.4 方法应用
• 4 结果分析
• 4.1 LF 纯化及优化结果
• 4.2 抗 LF 抗体的制备与纯化
• 4.3 金探针的制备
• 4.4 检测方法的建立
• 4.5 检测方法的优化
• 4.5.1 金探针的工作浓度
• 4.5.2 作用时间
• 4.5.3 最佳缓冲液中BSA浓度
• 4.5.4 检测最佳pH值
• 4.5.5 检测最佳温度
• 4.5.6 标准曲线建立
• 4.6 检测方法评价试验及应用
• 4.6.1 特异性试验
• 4.6.2 样品回收试验
• 4.6.3 重复性试验
• 4.6.4 初步应用
• 5 讨论
• 5.1 纯化LF的方法
• 5.2 抗LF抗体的制备与纯化
• 5.3 金探针的制备
• 5.4 检测方法的建立及优化
• 5.5 方法评价实验及初步应用
• 6 结论
• 参考文献
• 英文摘要