柑橘胚胎发生过程中DNA甲基化/去甲基化研究及SSR标记开发

论文摘要

柑橘是一种重要的木本作物，充分利用各种分子标记是柑橘育种的一个重要手段。本研究主要进行了两种标记在柑橘上的开发和利用。第一种是MSAP标记的开发和利用。MSAP（methylation-sensitive amplification polymorphism）是一种AFLP与DNA甲基化相结合的标记。DNA甲基化是DNA的一种重要修饰，在基因的表达调控中起了重要作用。通过愈伤组织再生是柑橘繁殖的一个重要途径，在现代生物技术上有着非常广泛的应用。然而调控柑橘愈伤组织再生的一些关键性因素尚未研究清楚，为这项技术的应用带来了诸多麻烦。本研究旨在利用MSAP标记筛选在愈伤组织再生过程中DNA甲基化的发生变化的位点，进而研究DNA甲基化在再生过程中的变化规律，希望以此为突破口，了解DNA甲基化在愈伤再生过程中的作用。第二种是微卫星标记的开发。微卫星标记是一种已在柑橘育种上广泛应用的标记，但目前可用的标记和种类都比较有限。在这个研究中，尝试利用生物信息学，直接从序列数据库中开发SSR标记，并获得了一定的成功。主要研究结果如下： 1 以伏令夏橙和山金柑为材料，分别建立了来源于同一胚状体的单胚系，并观测了愈伤再生过程的畸形状况。再生过程中畸形的主要有胚状体发育畸形，子叶畸形和叶型，节间距、株型不正常。胚状体在产生畸形植株的过程中，也能产生非畸形植株；畸形植株在随后的生长过程中还能恢复正常株型，具有一定的不均一性和可逆性。这和拟南芥上有关DNA甲基化导致的畸形有一定的相似性。 2 以来源于同一单胚系的愈伤、胚状体、叶片以及长期继代的愈伤为材料建立了一个山金柑MSAP试验体系。在PstI/MseI酶切组合中筛选了40对引物，发现了53个多态性位点。在14paII/EcoRI和MspI/EcoRI酶切组合中筛选了32对引物，一共发现了19个多态性位点。证明了这种方法可以用于再生过程中DNA甲基化分析。 3 这些多态性的带表现出三种类型，一是从愈伤到叶片，带逐渐消失；二是从愈伤到叶片，带逐渐出现；三是从愈伤到叶片，带先出现又消失。这个结果意味着在愈伤再生过程中，不同位点DNA甲基化变化规律不同，DNA甲基化水平可能升高，也可能降低，表现出位点特异性。总体上讲，DNA甲基化水平在新鲜愈伤中最低，继代和再生过程都会上升。部分位点经克隆后用作探针进行southern blotting杂交，证实了这些MSAP的带型。 4 对部分多态性带进行克隆和序列分析。19个多态性带克隆测序后，发现部分带可能来自多个位点。对这些序列进行Blast分析后，有18条序列发现了同源序列，

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 前人研究进展
• 1.2.1 DNA甲基化及其特点
• 1.2.2 DNA甲基化在植物发育过程中起着重要作用
• 1.2.3 DNA甲基化与植物防御系统
• 1.2.4 DNA甲基化的变化规律
• 1.2.5 DNA甲基化与逆境
• 1.3 DNA甲基化的研究方法
• 1.3.1 基于重亚硫酸处理的DNA甲基化的分析技术
• 1.3.1.1 基因组重亚硫酸盐测序法
• 1.3.1.2 MALDI-TOF MS
• 1.3.1.3 亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法（COBRA）
• 1.3.1.4 甲基化特异性PCR（MS-PCR）
• 1.3.2 不依赖重亚硫酸盐处理的DNA甲基化的分析技术
• 1.3.2.1 Southern blotting法
• 1.3.2.2 色谱或电泳法
• 1.3.3 MSAP技术
• 1.4 微卫星标记开发的研究进展
• 1.4.1 SSRs的生物学功能
• 1.4.2 SSRs的丰度和分布规律
• 1.4.3 SSRs标记的类型和应用
• 1.4.4 SSRs标记的开发方法及工具
• 第二章 柑橘单胚系的建立及MSAP分析
• 2.1 实验材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 材料的准备
• 2.2.2 单胚系的建立
• 2.2.3 AFLP和MSAP分析
• 2.2.3.1 引物和接头（adapter）合成
• 2.2.3.2 AFLP模板DNA制备
• 2.2.3.3 DNA扩增反应
• 2.2.3.4 凝胶电泳
• 2.2.3.5 MSAP分析
• 2.2.3.6 SOUTHERN BLOTTING
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 山金柑和伏令夏橙单胚系的建立
• 2.3.1.1 山金柑和伏令夏橙胚状体的诱导和植株的再生的特点
• 2.3.1.2 再生过程中的畸形现象
• 2.3.2 再生过程中MSAP（Methylation Sensitive Amplification Polymorphism）分析
• 2.3.2.1 AFLP分析
• 2.3.2.2 HpaII,MspI/EcoRI酶切组合的MSAP
• 2.3.2.3 PstI/MseI酶切组合的MSAP
• 2.3.3 MSAP结果的Southern blotting验证
• 2.4 讨论
• 2.4.1 MSAP是一种有效的检测DNA甲基化变化的方法
• 2.4.2 愈伤的长期继代与DNA甲基化
• 2.4.3 愈伤再生与DNA甲基化
• 第三章 MSAP多态性片断的克隆与分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 多态性片段的克隆测序分析
• 3.1.3 TAIL-PCR
• 3.1.3.1 TAIL-PCR引物
• 3.1.3.2 PCR反应体系
• 3.1.4 TAIL—PCR的改进
• 3.1.4.1 BlastX分析和聚类
• 3.1.4.2 特异引物和简并引物
• 3.1.4.3 PCR反应及产物筛选及测序
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 多态性带回收,测序及序列分析
• 3.2.2 片段361的序列分析
• 3.2.2.1 片段361特点及southern blotting分析
• 3.2.2.2 片段361侧翼序列的克隆
• 3.2.3 片段Ms02的序列分析
• 3.3.2.1 简并引物的设计
• 3.3.2.2 Ms02侧翼序列的克隆
• 3.3.2.3 Blast及表达分析
• 3.3 讨论
• 3.4.1 片段361是否来自反转录转座子,是否受DNA甲基化调控
• 3.4.2 片段Ms02的作用,是否受DNA甲基化调控
• 3.4.3 提高了效率的TAIL-PCR
• 第四章 柑橘SSR标记的开发与应用
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 总DNA的提取
• 4.1.3 PC的配置
• 4.1.4 MISA使用环境的建立及使用
• 4.1.4.1 Activeperl引擎的建立
• 4.1.4.2 MISA的安装及使用
• 4.1.5 Sputnik的使用方法
• 4.1.6 Alignment工具
• 4.1.7 引物设计
• 4.1.8 PCR扩增反应体系
• 4.1.9 SSR的检测
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 序列的获取与预处理
• 4.2.2 不同软件效率的比较
• 4.2.3 SSR的出现频率与密度
• 4.2.4 各类SSR的分布规律
• 4.2.5 冗余和非冗余数据组的比较
• 4.2.6 SSR标记的开发
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 图版和说明
• 发表的有关文章
• 致谢