论文摘要
目的近年来,美国科学家发现高尔基体蛋白73（GP73）有可能成为更好的诊断肝癌的血清标志物。但是目前国内外都使用多克隆抗体检测GP73,由于多克隆抗体制作的重复性差,且不能大规模生产,所以临床应用受到了限制。本实验探讨采用单克隆抗体检测GP73蛋白在肝细胞肝癌（HCC）诊断中的敏感性和特异性。方法为了临床大规模检测肝癌病人血清GP73表达水平,我们首先要制备GP73单克隆抗体。本实验首先将GP73抗原（4μg/ml）免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,基础免疫和加强免疫之后,取血测定抗体滴度。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%PEG作用下融合。经反复筛选杂交瘤细胞和杂交瘤细胞的克隆化,接着向BALB/c小鼠腹腔接种杂交瘤细胞,1周后取腹水,离心取上清液,用蛋白A亲和层析方法进行纯化。紫外分光光度计测量抗体蛋白溶液OD280nm值,利用公式C（mg/ml蛋白）=OD280nm/1.43计算抗体浓度。为了探讨单克隆抗体检测GP73蛋白在肝癌诊断中的敏感性和特异性,本实验采用Western Blotting法测定人血清中GP73蛋白相对含量。待测血清经过电泳后,使用iBlot快速转膜仪进行转膜。牛奶或BSA封闭后,置于杂交膜内,加一抗4℃摇床孵育。TBST洗脱后,接着加二抗室温孵育,TBST洗脱后,使用ECL暗室曝光。X光片扫描后,分析各条带的灰度值。结果使用单克隆抗体检测正常人群的GP73水平（1.3±0.1）RU（relative unit）,肝癌组血清GP73水平与对照组相比显著增高（5.8±.8）RU vs. （1.3±0.1）RU, P<0.001;肝癌组血清GP73水平（多克隆抗体）与对照组相比显著增高（7.8±0.7）RU vs. （1.1±0.03）RU, P<0.001; GP73单抗诊断HCC的敏感性和特异性分别为84.7%和93.5%,GP73多抗诊断HCC的敏感性和特异性分别为78.0%和93.5%,而采用AFP诊断HCC的敏感性和特异性分别为67.8%和74.2%。Logistic回归分析,GP73单抗的优势比（OR）为7.18,而GP73多抗的OR为1.51。结论单克隆抗体可以检测肝癌患者血清GP73蛋白水平,比AFP具有更高的敏感性和特异性,也可能优于目前使用的GP73多克隆抗体的检测。
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