污水厂耐β-内酰胺类抗生素乳糖发酵型肠道杆菌耐药基因的研究

论文摘要

随着抗生素在临床治疗和畜牧业上的广泛使用,近年来在环境中越来越多的检测到了抗性菌株的存在。抗性微生物的存在对人类以及动物的健康已经造成了很大的威胁,β-内酰胺类抗生素是目前使用最广泛的一类抗生素,在经过半个世纪的使用之后目前环境中已经充斥了多种β-内酰胺抗性菌株。本文研究了市政污水厂进水、活性污泥和出水中产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）乳糖发酵型肠道杆菌的表型和基因型的特性,以及质粒介导产生的AmpC酶的分布,并初步探讨了造成污水厂细菌产生抗性的机制和原因。在本研究中首先采用了传统微生物学方法,对污水厂中采集的水样进行分离培养,并在选择培养基上添加了β-内酰胺类抗生素分离出了β-内酰胺类抗性菌株。实验结果表明,在分离出的抗性乳糖发酵型肠道杆菌占总乳糖发酵型肠道杆菌的70%以上,虽然在经过一系列的处理工艺后,污水中抗性菌的比例有了一定程度上的降低,紫外前后抗性菌株比例由67%降低到10%左右,但是很大一部分细菌还是随着污泥和出水进入了环境中。对从污水处理厂分离出的558株β-内酰胺抗性菌株采用现代分子生物学技术,分析了污水厂中耐β-内酰胺抗性菌株中ESBLs和质粒介导的AmpC酶的基因型。检测到的β-内酰胺酶编码基因有：TEM、SHV、CTX-MU、ACT、DHA、CMY,其中TEM的检出率高达50.39%-100%,此外CTX-MU和CMY的检出率分别为14.87%和11.83%,未检测出ACC基因型。在检测出的抗性菌株中,携带一种基因型占49.8%,携带两种基因型为18.6%,三种及三种以上基因型比列为5.4%。通过对分离出的558株抗性菌株中含多重耐药基因菌株中随机选取了17株提取了质粒DNA,并且检测了位于质粒DNA上的抗性基因。从研究结果可以看出,在质粒DNA上都检测到了抗性基因的存在,证明了目前大多数抗性酶是通过质粒介导产生。通过16SrDNA测序,检测到这些细菌同大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、气单胞菌、弗氏柠檬酸菌和志贺氏菌的同源性都在99%以上。本研究针对含有两种以上抗性基因型的111株抗性菌株检测其中Ⅰ类整合子以及基因盒的存在情况。从实验结果可以看出,26.1%的抗性菌株携带了Ⅰ类整合子基因,15.2%的携带耐药基因盒,检测到同时携带Ⅰ类整合子-基因盒系统的抗性细菌阳性率为10.81%。为了确定环境中大量抗性细菌产生的原因,在本研究中以细菌接合实验辅助耐药基因定位,对抗性基因的水平转移进行了一系列的研究。结果表明污水厂中抗性细菌中确实存在这抗性基因的水平转移,通过基因突变和两性遗传细菌的抗药性的产生远远没有目前的速度快,很大一部分是通过位基因水平转移产生的。另外通过质粒的消除实验进一步验证了本研究中抗性基因的水平转移是通过位于质粒上基因水平转移产生的。本研究为今后临床抗生素的使用以及污水厂对耐药细菌的研究以及控制提供了依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 前言
• 1.1.1 Penicillium发现之前的年代
• 1.2 β-Lactam的发现及在临床使用上的发展
• 1.2.1 penicilin的发现
• 1.2.2 Penicillin应用于临床
• 1.2.3 Penicillin类B-lactam抗生素
• 1.2.4 β-lactam类衍生物
• 1.3 β-lactam的作用机制
• 1.3.1 生理学分析
• 1.3.2 生化分析
• 1.3.3 胞壁质的生物合成
• 1.3.4 生物物理分析
• 1.3.5 遗传学分析
• 1.4 细菌对抗生素产生抗性
• 1.5 β-内酰胺酶
• 1.6 染色体上β-内酰胺酶诱导机制
• 1.6.1 ampC
• 1.6.2 ampR
• 1.6.3 ampD和ampE
• 1.6.4 ampG
• 1.7 胞壁质的循环和β-内酰胺酶的诱导
• 1.8 本课题的研究意义和研究内容
• 1.8.1 本课题的研究意义
• 1.8.2 研究的主要内容
• 参考文献
• 2 污水处理厂耐β-内酰胺类抗生素乳糖发酵型肠道杆菌研究
• 2.1 前言
• 2.1.1 乳糖发酵型肠道杆菌简介
• 2.1.2 采样点简介
• 2.1.3 用于污水厂中耐β-内酰胺类抗生素的传统微生物分离培养方法
• 2.1.4 研究意义和主要内容
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 样品的采集
• 2.2.2 细菌总数的测定
• 2.2.3 耐β-内酰胺类抗生素细菌的分离培养
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 细菌总数计数结果
• 2.3.2 乳糖发酵型肠杆菌总数计数结果
• 2.3.3 耐β-内酰胺类抗生素肠道杆菌计数结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 闵行污水厂细菌总数计数结果分析
• 2.4.2 不同处理工艺下LFE和抗性LFE的变化
• 参考文献
• 3 污水处理厂耐β-内酰胺类抗生素基因型研究
• 3.1 前言
• 3.1.1 β-内酰胺类抗生素的作用机制
• 3.1.2 细菌对β-内酰胺类抗生素的抗性机制
• 3.1.3 β-内酰胺酶简介
• 3.1.4 课题研究内容和研究意义
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 β-内酰胺抗性菌株基因型研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 闵行污水处理厂分离的氨苄西林钠抗性菌株抗性基因PCR检测结果
• 3.3.2 闵行污水处理厂分离出的头孢呋辛钠抗性菌株抗性基因PCR检测结果
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 4 耐β-内酰胺类乳糖发酵型肠杆菌质粒DNA对耐药基因的验证
• 4.1 前言
• 4.1.1 质粒种类及特征
• 4.1.2 抗性质粒
• 4.1.3 质粒分类
• 4.1.4 质粒介导的抗性机制
• 4.1.5 研究意义和主要内容
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 抗性菌株质粒抽提
• 4.2.3 PCR检测质粒携带的耐药性基因
• 4.2.4 多重耐药基因携带菌株的16SrDNA基因片段扩增
• 4.2.5 PCR产物的纯化及基因测序
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 质粒抽提结果
• 4.3.2 质粒DNA上抗性基因检测结果
• 4.4.3 多重抗性基因携带菌株测序结果
• 4.5 讨论
• 参考文献
• 5 污水处理厂耐β-内酰胺类乳糖发酵型肠杆菌Ⅰ类整合子及相关基因的研究
• 5.1 前言
• 5.1.2 整合子的结构
• 5.1.3 整合子的分类
• 5.2 基因盒
• 5.2.1 基因盒的结构
• 5.2.2 基因盒的种类
• 5.2.3 耐药基因盒的表达
• 5.3 材料和方法
• 5.3.1 菌株
• 5.3.2 DNA模板的制作
• 5.3.3 抗性菌株Ⅰ类整合子基因检测
• 5.3.4 抗性菌株Ⅰ类整合子基因盒检测
• 5.3.5 带Ⅰ类整合子抗性菌株整合子位置确定
• 5.3.6 β-内酰胺类抗性LFE对多重抗生素的耐药性研究
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 抗性菌株Ⅰ类整合子检测结果
• 5.4.2 β-内酰胺类抗性菌株多重耐药性研究
• 5.4.3 含有Ⅰ类整合子-基因盒系统的抗性菌株中Ⅰ类整合子位置的确定
• 5.5 讨论
• 5.5.1 闵行污水厂中多重抗性基因携带的耐药菌Ⅰ类整合子-基因盒系统检测
• 5.5.2 整合子在介导LFE对抗生素产生多重抗性中的作用
• 5.5.3 抗性LFE中整合子-基因盒位置分析
• 参考文献
• 6 污水处理厂耐β-内酰胺类抗性基因水平转移研究
• 6.1 前言
• 6.1.1 基因水平转移机制概述
• 6.1.2 检测基因水平转移方法概述
• 6.1.3 基因水平转移载体
• 6.1.4 细菌发生基因水平转移特点
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 菌株
• 6.2.2 混合培养检测菌株基因水平转移
• 6.2.3 转移子基因组DNA的提取
• 6.2.4 接合子质粒DNA提取
• 6.2.5 转移子基因组DNA和质粒DNA抗性基因片段扩增
• 6.2.6 转移子Ⅰ类整合子检测
• 6.2.7 消除质粒后检测转移子耐药性
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 基因水平转移实验混合培养结果
• 6.3.2 转移子基因组DNA提取结果
• 6.3.3 转移子质粒DNA提取结果
• 6.3.4 转移子基因组DNA及质粒DNA抗性基因片段扩增结果
• 6.3.5 转移子Ⅰ类整合子基因扩增结果
• 6.3.6 转移子质粒消除后抗性检验结果
• 6.4 讨论
• 参考文献
• 7 总结与展望
• 7.1 总结
• 7.2 展望和建议
• 7.2.1 展望
• 7.2.2 建议
• 致谢