转基因大豆在贮藏和加工过程中外源epsps成分变化规律的研究

论文摘要

epsps（5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase）基因是美国孟山都公司开发的转基因大豆中抗草甘膦的靶基因,它与莽草酸途径密切相关。自从转基因问世以来,转基因作物种类不断增加,导致人们对转基因的安全,特别是转基因食品的安全越来越担心,因此世界各国都对转基因食品的溯源和标识越来越关注。有相关报道证明,转基因外源成分在食品加工过程中受到各种不同的加工因素的影响。因此,本文采用PCR、蛋白质印迹的方法进一步研究大豆中epsps成分在储藏、加工过程的变化。试验一转基因大豆粉在真空和普通环境（4℃、25℃、37℃）的条件下储藏一段时间（10、30、50、70、90d）后,分析其外源epsps成分的变化情况。结果显示,真空包装的大豆粉中转基因蛋白有轻微降解,核酸基本没有变化；普通包装样品,25℃储藏的大豆粉的基因和蛋白在50天时发生明显降解,37℃时发生降解的情况稍微延迟。在整个过程中,蛋白检测结果显示,稳定性：外源蛋白的中间和羧基端>氨基末端;核酸检测结果显示,稳定性：35S启动子<nos终止子和epsps（517-854区间）。结合两种储藏环境,对比结果可以发现,在储藏过程中,对epsps基因和蛋白的影响：湿度>温度。试验二大豆分离蛋白作为肉品中重要添加剂之一,存不存在转基因成分与功能食品和肉制品密切相关。因此,本试验通过试验一建立的方法对江苏周边地方市售的大豆分离蛋白进行调查,发现在所检测的5个城大豆分离蛋白中至少有2种以上的大豆分离蛋白存在转基因成分。试验结果表明,市售的转基因大豆分离蛋白中,DC-16抗体所对应的蛋白区域较为稳定（降解条带为46.5kD,41.9kD,35.5kD）,核酸1111-1429bp之间的序列稳定性较好,且半定量检测灵敏度较高。试验三为了进一步研究大豆分离蛋白在整个肉品加工过程中的变化过程,本试验采用河南安阳生产的转基因大豆分离蛋白按8%的质量比添加到香肠中,并分步（腌制、烘烤、蒸煮、灭菌）取样,研究转基因大豆分离蛋白在加工香肠中的变化情况。研究发现,加工过程中的不同的加工条件对大豆分离蛋白的纯度以及Western-Blot技术局限性的存在影响,且转基因大豆分离蛋白在肉制品中最低的含量检测限为2%（wt/wt）。同时经过检测发现,在试验二中能够检测到的降解条带在加工过程中由于使用量和加工因素的影响,难以用Western-Blot的方法检测,同时对比三个抗体可以发现,DC-17抗体和CK-17抗体检测灵敏度较高,在整个加工过程中均能检测到目的条带47.6kD。与蛋白相比,核酸在整个加工过程中降解片段小于600bp。综上所述,epsps成分在整个食品链中存在着降解,为了提高对于转基因食品的检测灵敏度,应针对在整个过程中外源蛋白和核酸的相对稳定区域,杜绝假阴性的产生。此外,为了降低人们对转基因食品安全性的担忧,在保证食品品质的前提下,应组合多种加工方式,降低食品中的epsps成分。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词中英文对照表
• 前言
• 文献综述
• 1 转基因大豆种植及我国现状
• 2 抗草甘膦转基因大豆的特征
• 3 转基因作物利与弊
• 3.1 转基因作物的优势
• 3.2 转基因作物的弊端
• 4 转基因作物的安全性评估
• 5 转基因作物及其制品检测技术现状
• 5.1 基于DNA片段的PCR检测方法
• 5.2 基于外源基因表达蛋白检测方法
• 6 不同加工因素对转基因作物内外源基因及蛋白的影响
• 7 本研究开展的目的和意义
• 参考文献
• 第一章 转基因大豆粉中EPSPS基因及其表达蛋白在储藏过程中的变化规律
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与处理
• 1.2 化学试剂与仪器设备
• 1.3 epsps基因提取方法
• 1.4 epsps基因表达蛋白提取方法
• 1.5 PCR体系及引物设计
• 1.6 epsps基因表达蛋白的SDS-PAGE电泳分析
• 1.7 epsps基因表达蛋白的Western-Blot分析
• 1.8 核酸测序比对
• 1.9 储藏样品SDS-PAGE分析以及Western-Blot分析
• 2 结果与分析
• 2.1 抗体效价与特异性分析
• 2.2 不同方法提取转基因大豆及其加工品基因比较
• 2.3 储藏转基因大豆粉核酸变化
• 2.4 储藏转基因大豆粉蛋白变化
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第二章 市售大豆分离外源EPSPS基因及其表达蛋白稳定片段分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与处理
• 1.2 化学试剂与仪器
• 1.3 大豆分离蛋白DNA提取
• 1.4 大豆分离蛋白PCR分析
• 1.5 大豆分离蛋白Western-Blot分析
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆分离蛋白DNA提取
• 2.2 大豆分离蛋白PCR分析
• 2.3 大豆分离蛋白SDS及Westem-Blot分析
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 肉制品中转基因大豆分离蛋白外源EPSPS成分在的变化规律
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与处理
• 1.2 化学试剂与仪器
• 1.3 大豆分离蛋白的核酸和蛋白定性检测
• 1.4 香肠的制备
• 1.5 Western-Blot检测限分析
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因大豆分离蛋白DNA提取
• 2.2 蛋白质提取及浓度测定
• 2.3 PBS方法提取率验证
• 2.4 添加转基因大豆分离蛋白香肠Western-Blot分析检测限
• 2.5 香肠加工过程中外源epsps蛋白的变化
• 2.6
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 附件
• 附件1. 转基因大豆外源EPSPS基因表达蛋白序列（GENEBANK：AB209952.1）
• 附件2. 转基因大豆外源EPSPS基因序列（GENEBANK：AB209952.1）
• 附件3. 大豆内源LECTIN基因序列（GENEBANK：K00821.1）
• 研究生期间发表的论文
• 致谢