论文摘要
目的:1.观察雌激素对实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis,EAE）的保护作用2.探讨雌激素对EAE保护作用的免疫学机制。方法:将40只雄性Wistar大鼠随机分成4组:正常对照组、EAE对照组、大剂量雌激素组和小剂量雌激素组,每组各10只。采用粗制髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）抗原注入EAE对照组及大、小剂量雌激素组大鼠后足掌皮下（0.2ml/100g）制作EAE模型,正常对照组注射等量生理盐水。自造模之日开始,小剂量雌激素组给予皮下注射苯甲酸雌二醇250μg/kg.d,大剂量雌激素组每日皮下注射苯甲酸雌二醇1mg/kg.d,正常对照组及EAE对照组每日皮下注射1mg/kg.d橄榄油,直至整个实验结束。EAE对照组及大、小剂量雌激素组连续3天症状评分无加重或四肢瘫痪、死亡时作为EAE发病高峰期。记录发病大鼠的发病率、发病潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分。于发病高峰期处死大鼠,正常对照组4周后处死,留取大鼠眶静脉血、脑脊髓组织。脑脊髓组织经处理切片行HE染色,光学显微镜下观察病理变化;免疫组化技术和平均光密度测定法检测各组大鼠脑和脊髓白质组织内CD44的表达情况;用酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）分泌IFN-γ、IL-4水平和高峰期脑组织细胞因子IL-10含量。采用放射免疫法测定正常对照组、EAE组和各治疗组高峰期脑组织细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量。结果:（1）大鼠发病情况:正常对照组大鼠未发病。EAE对照组均有不同程度发病,发病率100%;大、小剂量雌激素组部分动物发病,小剂量组发病率为80%,与EAE对照组比较差异无统计学意义（P >0.05）,大剂量组发病率为50%,较EAE对照组增高（P<0.05）,但与小剂量组比较差异无统计学意义（P >0.05）;EAE对照组发病潜伏期为11.6±2.5天,小剂量雌激素组潜伏期（17.5±1.6天）较EAE对照组延长,差异有统计学意义（P<0.01）,大剂量雌激素组潜伏期（24.2±3.0天）较EAE对照组及小剂量雌激素组均明显延长（P<0.01）;EAE对照组发病进展期为7.4±1.7天,小剂量雌激素组进展期（5.1±1.4天）较EAE对照组明显缩短（P<0.01）,大剂量雌激素组进展期（3.2±0.8天）较EAE对照组及小剂量雌激素组明显缩短（P <0.01,P<0.05）;EAE对照组发病高峰期神经功能障碍评分为3.1±1.1分,小剂量雌激素组神经功能障碍评分1.5±1.1分,较EAE对照组明显降低（P<0.01）,大剂量雌激素组神经功能障碍评分（0.6±0.7分）较EAE对照组明显降低（P <0.01）,大剂量雌激素组神经功能障碍评分比小剂量雌激素组低,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）EAE对照组、大小剂量雌激素组大鼠脑及脊髓病理学改变:正常对照组大鼠脑和脊髓无异常。EAE对照组大鼠高峰期可见脑及脊髓实质内小血管充血,血管周围主要是小静脉周围有大量炎性细胞浸润,主要为单个核细胞浸润,典型者形成“袖套”状改变,血管周围白质脱髓鞘改变。而小剂量雌激素组病理改变较轻,大剂量组最轻。（3）EAE对照组、大小剂量雌激素组大鼠CNS内CD44表达情况: CD44表达部位主要在大脑、脑干、脊髓白质及灰白质交界的小血管周围。其主要分布在神经细胞胞浆,CD44高表达部位的炎症表现较重。正常对照组大鼠CNS内未发现CD44阳性细胞;EAE对照组大鼠CNS白质及灰白质交界处可见大量阳性细胞,呈棕黄色浓染颗粒,着色较深;大小剂量雌激素组大鼠CNS内仅有少量散在淡染的阳性细胞。图像分析结果显示,与大剂量雌激素组及小剂量雌激素组比较,EAE对照组CNS白质CD44表达水平均明显升高（P <0.01）;与小剂量雌激素组比较,大剂量雌激素组CNS白质的CD44表达水平显著降低（P <0.01）。（4）EAE对照组、大小剂量雌激素组大鼠PBMC分泌IFN-γ、IL-4能力:正常对照组PBMC分泌的IFN-γ水平为0.32±0.08ng/ml,EAE对照组分泌的IFN-γ水平为0.69±0.07ng/ml,EAE对照组较正常对照组明显升高（P <0.01）,大、小剂量雌激素组分泌的IFN-γ水平分别为0.35±0.04ng/ml、0.42±0.04ng/ml,均较EAE对照组显著下降（P <0.01）,大剂量雌激素组较小剂量雌激素组下降更明显（P <0.05）;正常对照组PBMC分泌的IL-4水平为18.98±1.40 pg/ml,EAE对照组分泌IL-4的水平为11.34±1.23 pg/ml,EAE对照组分泌较IL-4的能力较正常对照组减低（P <0.01）,大、小剂量雌激素组分泌的IL-4水平分别为26.19±1.74pg/ml、24.40±1.89pg/ml,均较EAE对照组显著升高（P <0.01）,大剂量雌激素组较小剂量雌激素组升高明显（P <0.05）;EAE对照组IFN-γ/IL-4比值（62.18±13.16）较正常对照组（16.95±5.45）明显升高（P <0.01）,大、小剂量雌激素组IFN-γ/IL-4比值分别是13.39±2.07、17.36±2.82,均较EAE对照组显著下降（P <0.01）,大剂量雌激素组IFN-γ/IL-4比值与小剂量雌激素组差异无统计学意义（P >0.05）。（5）细胞因子含量:EAE对照组脑组织IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量较正常对照组高（P<0.01或P<0.05）,雌激素大、小剂量治疗组脑组织IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量较EAE对照组低（P<0.01或P<0.05）,雌激素大剂量治疗组脑组织IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量较雌激素小剂量治疗组明显减低（P<0.01或P<0.05）。EAE对照组脑组织IL-10含量较正常对照组明显降低（P<0.01）,雌激素大、小剂量治疗组脑组织IL-10含量较EAE对照组明显增高（P<0.05,P<0.01）,雌激素大剂量治疗组脑组织IL-10含量较雌激素小剂量治疗组增高（P<0.05）。（6）相关性分析:EAE对照组及大小剂量雌激素组发病高峰期CD44表达与发病潜伏期呈负相关（P<0.01或P<0.05）,与发病进展期、高峰期神经功能障碍评分呈正相关（P<0.05或P<0.01）。EAE对照组及大小剂量雌激素组发病高峰期外周血IFN-γ/ IL-4比值与发病潜伏期呈负相关（P<0.01或P<0.05）,与发病进展期、神经功能障碍评分呈正相关（P<0.01或P<0.05）。脑组织炎性细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α）含量与EAE对照组及雌激素各治疗组发病的潜伏期呈负相关（P<0.01或P<0.05）,与进展期和高峰期神经功能障碍评分呈正相关（P<0.01或P<0.05）。脑组织IL-10含量与EAE对照组及雌激素各治疗组发病的潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分无明显相关性（P>0.05）。结论:1.本实验以豚鼠脊髓粗制MBP为免疫原诱导大鼠EAE模型,EAE大鼠神经功能障碍明显,脑和脊髓血管周围炎性细胞浸润、白质脱髓鞘,说明本法造模成功、可靠、稳定。2. EAE大鼠存在免疫失衡,发病高峰期体内Th1型细胞因子IFN-γ增多,Th2型细胞因子IL-4减少,Th1/Th2细胞比例失衡,脑组织炎性细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α）产生增加,抑制性细胞因子IL-10生成减少。免疫格局向Th1型偏移。其免疫功能异常与EAE大鼠发病的潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分密切相关。3. EAE大鼠发病期CD44表达上调,CD44表达与EAE潜伏期呈负相关,与进展期、神经功能障碍评分呈正相关,经雌激素治疗表达降低,提示CD44与EAE发生发展有关。4.雌激素对EAE有保护作用,可有效改善EAE的临床症状,降低发病率,延缓发病时间,抑制中枢神经系统的炎症细胞浸润、髓鞘脱失和轴突损伤,其保护作用大小与剂量呈正相关。5.雌激素可能通过抑制Th1细胞活性、提高Th2细胞分泌能力、逆转Th1/Th2失衡、抑制炎性细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α）产生、促进抑制性细胞因子IL-10生成,抑制黏附分子CD44的表达而发挥对EAE大鼠的治疗作用。
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标签：实验性变态反应性脑脊髓炎论文; 雌激素论文; 细胞因子论文; 细胞论文;