红麻叶片全长cDNA文库的构建及ESTs分析

论文摘要

红麻（kenaf）为锦葵科（Malvaceae）木槿属（Hibiscus）一年生韧皮纤维作物,是重要的麻纺工业原料作物。迄今为止,红麻的分子生物学和功能基因组学研究极为缺乏,有的领域甚至是空白,很难借鉴其它植物研究其功能基因。因此,构建红麻叶片全长cDNA文库,随机挑取单克隆进行测序,并对EST序列进行分析可以为红麻相关基因的克隆和分子生物学研究奠定基础。本研究以福建农林大学育成的高产优质抗病新品种福红992为材料,利用SMART技术构建红麻叶片全长cDNA文库,随机挑选克隆进行双向测序,再利用软件对EST序列进行处理和分析,具体研究结果如下：1、红麻叶片中单宁、酚类、糖类物质比较多,RNA提取难度较高,而RNA的纯度和完整性是影响cDNA文库质量的关键因素,本研究用六种方法（Trizol法、蛋白酶K法、SDS法、CTAB法、通用植物试剂盒和多糖多酚试剂盒）提取红麻叶片总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测,结果显示SDS法和通用植物试剂盒法提取红麻总RNA的效果都较为理想,能够满足后续实验的要求。2、利用SMART技术成功构建了红麻叶片全长cDNA文库,经文库质量鉴定表明：文库的滴度为1.34×106 （cfu/mL）,符合实验要求,通过随机挑取24个单克隆进行菌液PCR, PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测发现24个单克隆全部成功插入载体,重组率为100%,其片段都在500bp-2000bp之间,平均长度为700bp。3、红麻叶片cDNA文库测序总共获得150条ESTs,去除低质量的EST序列后,最终获得了147条高质量的EST序列,占全部测序量的98%。这147条EST有效序列长度跨度为148bp-1249bp,全部有效序列总长度为78348.06bp,平均长度532.98bp。利用phrad软件进行序列拼接后得到60个unigenes,其中有12个contigs,48个singlets。4、通过BlastX程序对红麻叶片中的60个unigenes进行同源序列比对和功能注释分析,35个unigenes比对成功,相似序列共来自17个物种。5、GO分类后,有17个基因在分子功能中得到了分类,依次分别是碳水化合物运输和代谢基因6个、能源产生和转换基因4个、翻译,核糖体的结构和生物发生基因2个、氨基酸运输与代谢基因1个、预测仅有全局功能基因1个、染色质结构和动力学基因1个、转录相关基因1个、翻译后修饰,蛋白质折叠及伴侣蛋白分子基因1个。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 红麻概述
• 1.1.1 红麻起源
• 1.1.2 红麻的综合利用
• 1.2 cDNA文库概述
• 1.2.1 全长cDNA文库
• 1.2.2 全长cDNA文库的构建方法
• 1.2.3 cDNA文库的应用前景及技术的局限性
• 1.2.3.1 cDNA文库的应用
• 1.2.3.2 cDNA文库的局限性
• 1.3 EST概述
• 1.3.1 EST技术简介
• 1.3.2 EST序列分析软件
• 1.3.3 EST技术应用
• 1.3.4 EST技术的局限性
• 1.4 课题学术及研究意义
• 1.5 创新之处
• 第二章 红麻叶片总RNA的提取
• 2.1 材料
• 2.2 主要仪器
• 2.3 试剂及用具器皿的处理
• 2.4 总RNA的提取
• 2.4.1 Trizol法参照杨成君方法并加以改良
• 2.4.2 蛋白酶K法参照武耀廷法并加以改良
• 2.4.3 SDS法参照杨成君法并加以改良
• 2.4.4 CTAB法参照胡根海法并加以改良
• 2.4.5 试剂盒法
• 2.5 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.6 紫外分光光度计检测
• 2.7 结果与讨论
• 2.7.1 结果
• 2.7.2 讨论
• 2.7.2.1 Trizol法
• 2.7.2.2 热硼酸法
• 2.7.2.3 SDS法
• 2.7.2.4 CTAB法
• 2.7.2.5 试剂盒法
• 2.8 本章小结
• 第三章 红麻叶片全长cDNA文库的构建
• 3.1 实验材料与菌株
• 3.2 主要仪器和试剂
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 实验主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.4 实验步骤
• 3.4.1 高质量红麻叶片总RNA的提取
• 3.4.2 红麻叶片cDNA第一链的合成
• 3.4.3 红麻叶片cDNA第二链的合成
• 3.4.4 双链cDNA的纯化
• 3.4.4.1 方案1：蛋白酶K消化
• 3.4.4.2 方案2：使用PCR产物纯化试剂盒
• 3.4.5 cDNA片段的分级分离
• 3.4.5.1 方案1：使用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离
• 3.4.5.2 方案2：使用回收试剂盒进行分级分离
• 3.4.6 载体连接与转化
• 3.4.6.1 载体连接
• 3.4.6.2 转化
• 3.4.7 初始文库滴度测定与文库扩增及保存
• 3.4.8 菌液PCR
• 3.5 结果分析
• 3.5.1 红麻叶片总RNA提取结果
• 3.5.2 红麻叶片cDNA第一链的合成结果
• 3.5.3 红麻叶片cDNA第二链的合成结果
• 3.5.4 双链cDNA纯化结果
• 3.5.5 红麻cDNA片段分级分离结果
• 3.5.6 cDNA文库质量检测结果
• 3.5.6.1 文库滴度测定结果
• 3.5.6.2 菌液PCR结果
• 3.6 讨论
• 3.6.1 总RNA的提取
• 3.6.2 双链cDNA的合成
• 3.6.3 双链cDNA的纯化与分级分离
• 3.6.4 双链cDNA的连接与转化
• 3.7 本章小结
• 第四章 EST测序及分析
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 单克隆的获得
• 4.2.2 测序
• 4.2.3 生物信息学分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 红麻叶片EST序列基本特征分析
• 4.3.2 同源序列比较与功能注释分析
• 4.3.3 红麻叶片EST同源序列物种来源
• 4.3.4 红麻叶片EST序列的基因GO分类结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 单克隆的获得
• 4.4.2 文库序列特征分析
• 4.4.3 unigene的同源序列比对及功能分析
• 4.4.4 红麻叶片EST序列的基因GO分类
• 4.5 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 致谢