论文摘要
脊髓肽MP1最初是从新鲜的猪骨髓细胞培养液的表层中提取出来的,其氨基酸序列是:Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr,它具有良好的免疫活性,能矫正具有免疫缺陷动物的免疫系统,恢复动物体内抗体产生的数量,调节和增强细胞的免疫功能,并且能促进ConA诱导的脾淋巴细胞的分裂繁殖。本论文研究的主要内容是:1)对脊髓肽MP1的固相合成工艺条件、树脂切割工艺条件和RP-HPLC分离条件进行优化,确定固相合成和分离脊髓肽MP1的较佳工艺条件。2)对固相合成出的多肽进行RP-HPLC、质谱和氨基酸分析,验证其是否为脊髓肽MP1。3)对纯化冻干后的脊髓肽MP1进行免疫活性的研究,验证化学合成的脊髓肽MP1是否具有同样的生物活性,以及生物活性与其剂量的关系。采用Fmoc法对脊髓肽MP1进行固相合成,通过探索了不同的缩合时间、树脂的浸泡时间、氨基酸的用量、缩合剂的浓度、催化剂的浓度、氨基酸的活化条件、树脂的用量克数与溶剂的体积数的比值以及每步反应中树脂的洗涤次数等对合成效率的影响,从而找出的脊髓肽MP1较佳的合成工艺条件为:80mg树脂浸泡于900μLDMF溶剂中,树脂的浸泡时间为40min,缩合剂HBTU/HOBt的浓度为0.5mmol·L-1,催化剂DIEA的浓度为1.5mmol·L-1,氨基酸的物质的量过量2倍,氨基酸活化条件是活化2次,每次7min,缩合时间为50min,每步反应脱Fmoc保护基后树脂的洗涤次数为6次。在此合成工艺条件下,根据树脂增重计算脊髓肽MP1的合成效率可达90%以上。应用酸类物质对合成产物脊髓肽MP1-Wang树脂进行树脂的切割和侧链的脱除,探索了不同的切割剂、切割时间和切割温度等对切割工艺条件的影响,从而找出的较佳切割条件为:采用TFA-水-EDT-TES（90:6:3:1）作为切割剂,在室温条件下切割3.5h。在此切割条件下,根据残留树脂的质量百分数来表示脊髓肽MP1-Wang树脂的切割效率,树脂的切割效率可达99%以上。应用RP-HPLC对粗品脊髓肽MP1进行分离纯化,探索了洗脱梯度、乙腈的浓度、流速、离子对试剂TFA的浓度和色谱柱等对脊髓肽MP1在RP-HPLC上分离效果的影响,从而确定的较佳分离条件为:在Waters反相高效液相色谱仪上,选用色谱柱为VP-ODS C18（150×4.6mm,5μm）,紫外检测波长为214nm,流动相为:A相0.1%TFA的水溶液;B相0.1%TFA/70%乙腈的水溶液,洗脱梯度为:5min,B相0→35%;35min,B相35%→55%,流速0.7mL·min-1。采用质谱仪LC-MS对粗品脊髓肽MP1进行分析鉴定,检测谱图表明:固相合成粗肽的分子离子峰是681.40为[M+H]+峰,与脊髓肽MP1的理论相对分子质量680.80基本一致,340.20对应的是脊髓肽MP1的双电荷碎片,这一鉴定结果表明合成的粗肽中含有脊髓肽MP1。采用氨基酸分析的方法对纯化后的脊髓肽MP1进行进一步的性质鉴定,其实验结果表明:实际测量的脊髓肽MP1的氨基酸残基的摩尔比与理论摩尔比基本一致。通过脾淋巴细胞转化实验的MTT法,对纯化后的脊髓肽MP1进行免疫活性的研究,探索了化学合成的脊髓肽MP1是否同样具有免疫调节活性及其剂量对生物活性的影响。结果表明:本论文固相合成的脊髓肽MP1具有免疫调节作用,能促进ConA诱导的脾淋巴细胞的分裂繁殖,且当脊髓肽MP1的剂量为1.00×10-3μg·mL-1时,这种免疫调节作用最明显。综上所述,本论文成功的合成制备了脊髓肽MP1,建立了其完整的固相合成、树脂切割和粗品分离的较佳工艺条件,并且验证了化学合成的脊髓肽MP1同样具有免疫调节的生物活性,及其剂量对生物活性的影响。