拟南芥、荠菜心皮发育相关基因CRABS CLAW cDNA克隆及交互转化

论文摘要

拟南芥（Arabidopsis thaliana）和荠菜（Capsella bursa-pastoris L.）是同为十字花科而不同属的草本植物,二者遗传背景、生理特性和生长分布都具有较高的同源性和相似性。但二者的心皮形态具有十分明显的差异,拟南芥为二心皮长角形形态而荠菜为二心皮心形结构。作为模式生物,拟南芥心皮发育相关基因已得以克隆,拟南芥心皮发育主要受CRABS CLAW（CRC）及SPATULA（SPT）基因的控制,二者都属于MADS box基因家族成员。尤其是CRC可抑制正在发育雌蕊的横向生长,促进其轴向生长。为了揭示CRC基因在心皮形态差异显著的两种植物中的差异性,本研究选取拟南芥和荠菜为材料,根据已报道的拟南芥心皮发育相关基因CRABS CLAW（CRC）信息,克隆出拟南芥、荠菜CRC基因的cDNA,并进行序列比对及同源性分析,同时采用转基因技术,将拟南芥CRC基因和克隆的荠菜CRC同源基因cDNA交互转化,获得了转基因拟南芥和荠菜。并对转基因植物开展了相关形态学观察及分子鉴定。取得了以下结果:1、克隆拟南芥、荠菜CRABS CLAW（CRC）基因cDNA;根据GenBank收录的拟南芥CRABS CLAW基因的cDNA序列设计引物,通过RT-PCR的方法,分别从哥伦比亚型拟南芥总RNA、野生型荠菜总RNA中扩增出CRABS CLAW基因的全长cDNA序列,测序证明拟南芥CRC序列与GenBank报道的序列完全一致。荠菜的CRC序列与GenBank报道的拟南芥序列达到93%左右的同源性。该基因已登录到GenBank,登录号:DQ119055。2、构建了拟南芥和荠菜CRC基因cDNA植物表达载体;以Ti质粒载体pWM101为基础,分别将已克隆的拟南芥和荠菜CRC cDNA重组,构建了由组成型启动子CaMV35S调控的CRC基因的植物表达载体,并命名为pWM-atCRC、pWM-cbCRC。3、拟南芥、荠菜CRABS CLAW（CRC）基因的交互遗传转化;以根癌农杆菌浸渍法、滴注花器、与愈伤共培等方法交互转化拟南芥和荠菜,筛选到转拟南芥CRC基因的荠菜植株和转荠菜CRC基因拟南芥植株。外部形态学观察及分子检测表明:拟南芥CRC基因和荠菜CRC基因已整合进荠菜基因组和拟南芥基因组中,二者在对应植株中的组成型表达对各自的心皮形态和大小都产生了一定影响,在拟南芥、荠菜变异株中心皮有的表现出加强的轴向增长,有的则呈现宽而短的结构,心皮表面出现凹凸不平等现象。4、比较了采用根癌农杆菌对拟南芥和荠菜的几种转化方法。为了提高农杆菌的转化效率,摸索较佳的转化途径,本研究对几种转化方法进行比较。结果表明:滴注花器法及浸渍植株法针对性强,对植株伤害小,后期恢复生长快,操作简便易行,转化效率有所提高。而叶盘与愈伤组织共培法,由于拟南芥、荠菜等叶片较小而薄,经农杆菌感染又经过抑菌筛选等步骤后难以恢复生长,愈伤共培后,生长缓慢,分化率低,后代筛选难度大。因此,在拟南芥、荠菜等小型植株的转化方法上,滴注法或浸渍法较好。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 拟南芥、荠菜简介
• 2 花器官发育的研究动态
• 2.1 花发育概述
• 2.2 花器官原基的形成
• 2.3 成花同源异型基因的特点
• 2.4 MADS-box蛋白质的特点及其功能
• 2.5 MADS-Box基因在果实发育、成熟过程中的作用
• 3 花器发育的相关基因
• 3.1 控制拟南芥心皮发育的相关基因
• 4 本研究的目的及意义
• 第二章 拟南芥、荠菜心皮发育基因CRABS CLAW（CRC）cDNA的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 酶与试剂盒
• 1.1.4 试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 拟南芥、荠菜RNA的提取及RNA质量检测
• 1.2.2 用RT-PCR的方法获得拟南芥、荠菜CRABS CLAW基因
• 1.2.3 拟南芥、荠菜CRABS CLAW（CRC）基因的PCR扩增
• 1.2.4 切胶回收目的基因片段
• 1.2.5 将回收的目的基因片段克隆到pMD18-T Vector上
• 2法制备及转化感受态细胞'>1.2.6 大肠杆菌CaCl₂法制备及转化感受态细胞
• 1.2.7 目的基因的鉴定
• 1.3 拟南芥、荠菜CRABS CLAW（CRC）基因序列的分析
• 2 实验结果与分析
• 2.1 拟南芥、荠菜总RNA提取
• 2.2 拟南芥、荠菜CRABS CLAW（CRC）基因的克隆
• 2.3 序列分析
• 2.3.1 拟南芥、荠菜CRABS CLAW（CRC）核苷酸的序列翻译
• 2.3.2 CRABS CLAW（CRC）的BLAST结果
• 2.3.3 拟南芥、荠菜CRABS CLAW（CRC）氨基酸序列分析
• 3 讨论
• 3.1 目的基因的获得
• 3.2 核酸序列、蛋白质序列的对比
• 第三章 拟南芥愈伤组织的诱导及植株再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.2 试剂与培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 外植体消毒与接种
• 1.2.2 拟南芥无菌苗的生长
• 1.2.3 愈伤组织的诱导
• 1.2.4 继代培养
• 1.2.5 芽的诱导分化
• 1.2.6 根的诱导分化
• 1.2.7 培养温度
• 1.2.8 光照
• 2 结果与分析
• 2.1 不同激素组合培养基对拟南芥无菌苗生长的影响
• 2.2 愈伤组织的诱导
• 2.3 愈伤组织继代培养
• 2.4 芽的诱导分化
• 2.5 根的诱导分化
• 3 讨论
• 3.1 赤霉素对拟南芥无菌苗生长的作用
• 3.2 外植体的选择
• 3.3 诱导根的分化时培养基的选择
• 3.4 植株的再分化能力
• 第四章 拟南芥、荠菜CRABS CLAW基因cDNA表达载体的构建及交互转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 植物材料与培养基
• 1.1.3 酶与试剂盒
• 1.1.4 试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 植物表达载体pWM-atCRC、pWM-cbCRC的构建及检测
• 1.2.2 表达载体pWM-atCRC、pWM-cbCRC转化根癌农杆菌
• 1.2.3 拟南芥、荠菜交互转化
• 1.2.4 转基因拟南芥、荠菜的PCR检测
• 1.2.5 转基因拟南芥、荠菜的形态检测
• 2 结果与分析
• 2.1 植物表达载体pWM-atCRC、pWM-cbCRC的构建流程
• 2.2 表达载体pWM-atCRC、pWM-cbCRC的菌落PCR和酶切检测
• 2.3 表达载体pWM-atCRC、pWM-cbCRC转化农杆菌LBA4404及检测
• 2.4 浸渍法、滴注法转化拟南芥、荠菜
• 2.4.1 浸渍法转化荠菜结果
• 2.4.2 滴注法转化拟南芥结果
• 2.4.3 共培法转化拟南芥愈伤结果
• 2.5 转基因拟南芥、荠菜的PCR检测
• r基因PCR检测结果'>2.5.1 Hyg^r基因PCR检测结果
• 2.5.2 CRC基因PCR检测结果
• 3 讨论
• 3.1 CRC基因的转化结果
• 3.2 拟南芥愈伤与工程农杆菌共培转化效果分析
• 3.3 工程农杆菌介导转化拟南芥、荠菜的方法摸索
• 3.4 几种转化方法的比较
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录A 拟南芥CRC基因测序报告
• 附录B 荠菜CRC基因测序报告
• 附录C CRC基因登陆GenBank
• 附录D 附缩略词表
• 附录E 主要试剂配置
• 附录F 载体图谱
• 致谢
• 作者简历