AtTPS03基因RNA干扰载体的构建与转化拟南芥的研究

论文摘要

罗勒烯是一种单萜挥发性有机物，在植物被取食或者受机械损伤从叶中散发出来，也是一种花香物质。空气传播的罗勒烯能作为一种气传信号分子，在不同的生物体之间起着化学通讯的作用。AtTPS03是AtTPS基因家族中一种萜烯合酶，Jenny等人通过cDNA克隆，鉴定了AtTPS03的基本功能，发现它能编码单萜合酶，这种单萜合酶能高特异性催化香叶基二磷酸成罗勒烯。此外，暴露植物到罗勒烯能激发植物防御基因的表达。刘春林等发现β—罗勒烯能诱导完整植物中与水杨酸和茉莉酸有关防御基因的表达，而且发现罗勒烯能解除水杨酸和茉莉酸的拮抗作用。AtTPS03对植物的生长发育、生理生化、抗性等是否还有其他的调控作用，我们通过RNAi技术进行了探索。RNAi技术是近几年发明的一种新兴技术，它能高效特异抑制相关基因的表达。我们根据RNAi的基本原理，构建了特定的表达载体，然后转入到拟南芥。期望使AtTPS03基因表达的效率大大降低，甚至导致其完全沉默。这样我们就有可能得到一些突变体，然后由其突变的表型推测AtTPS03基因对植物的生长发育、生理生化、抗性等的调控作用。主要的结果如下：1．AtTPS03基因片断的克隆与序列分析克隆的片段与AtTPS03基因AY151086核苷酸的同源性为99％，氨基酸序列的同源性为99％，因此可以用来构建干扰载体。2．AtTPS03基因干扰载体的构建扩增出的AtTPS03基因片段正反向连接到质粒pFGC5941上，通过菌落PCR、质粒PCR、酶切等进行验证，发现正反向基因片段均已插入到了载体当中，这样干扰载体就构建成功。3．遗传转化我们通过根癌农杆菌LBA4404的介导作用，把构建好的干扰载体转化到拟南芥。对于转化子的筛选，我们先用野生哥伦比亚型拟南芥探索到最佳筛选的PPT浓度为3.0mg／L。当用PPT对转化种子进行筛选时，发现25株转化苗在PPT的浓度为3.0 mg／L的MS培养基上能正常生长，对PPT具有抗性。通过序列比对发现，拟南芥中无质粒pFGC5941内含子的同源序列，因此，对这25株抗性苗提DNA，设计合适的引物扩增质粒pFGC5941的内含子序列与两端的AtTPS03基因片断，扩增到2100bp左右大小的片断，与质粒pFGC5941的内含子序列加2AtTPS03基因片断大小一致，说明干扰载体已经转入到了拟南芥中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.植物功能基因研究技术
• 1.1 利用诱导产生突变进行基因功能分析的技术
• 1.2 根据DNA序列直接进行基因功能研究的技术
• 1.3 利用生物芯片进行基因功能研究
• 2.RNAi的研究
• 2.1 RNAi的发现
• 2.2 RNAi机制
• 2.3 RNAi的应用
• 2.4.RNAi技术应注意的问题
• 3.miRNA的研究
• 3.1 miRNA的发现
• 3.2 miRNA的特征与功能
• 3.3 miRNA的作用机制
• 3.4 miRNA与siRNA的比较
• 3.5 miRNA的应用与展望
• 4.siRNA的设计
• 4.1.化学合成
• 4.2 体外转录
• 4.3 用RNase Ⅲ消化长片断双链RNA制备siRNA
• 4.4 siRNA表达载体
• 4.5 siRNA表达框架
• 5.植物通讯与AtTPS03基因功能的研究
• 6.本研究的目的与意义
• 第二章 试验研究
• 1.材料和方法
• 1.1 植物材料与菌株
• 1.2 药品试剂与主要仪器设备
• 1.3 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 AtTPS03基因片断的克隆
• 2.2 AtTPS03基因片断的序列分析
• 2.3 RNA干扰载体的构建
• 2.4 遗传转化
• 3.小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 技术路线图
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介