Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及重组蛋白ELISA鉴别诊断方法的研究

论文摘要

禽腺病毒（FAV）归为腺病毒科禽腺病毒属,根据抗原性差异,分为3个群。I群禽腺病毒（FAVI）具有共同的群抗原,共12个血清型（FAV1-FAV12）,在鸡、鸭、鹅体内普遍存在,呈隐性感染,与其他病原共同作用于家禽。2008-2010年从广西南宁市活禽市场采集259份样品,通过SPF鸡胚传代增殖与PCR鉴定,分离到92份FAV,阳性率为35.5%（92/259）。选取不同年份的8株,进行血凝性、免疫琼脂扩散、形态学、致细胞病变和鸡胚致病性试验。结果显示,8株均不凝集鸡红细胞,能与FAVI阳性血清反应,具有腺病毒粒子的典型特征,致细胞变圆、折光性增强,使鸡胚发育不良。克降8株hexon基因,经序列分析,均与FAVI同源性最高。经遗传进化分析,均与FAVI亲缘关系最近,结果表明,8株分离株为FAVI。根据GenBank中FAVI hexon、penton、100K、33K基因序列,设计引物,经PCR扩增,与pGEX-4T-1载体连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经IPTG诱导,表明四种重组蛋白得到良好表达；经可溶性分析,表明hexon、penton表达产物以包涵体的形式存在,100K、33K表达产物以可溶性的形式存在；经纯化,表明四种重组蛋白达到了较高的纯度和浓度；经western-blot检测,具有良好的反应原性,可作为间接ELISA的诊断抗原。以hexon和penton结构蛋白分别作为包被抗原,建立检测FAVI抗体的间接hexon-ELISA和penton-ELISA力法。结果农明,抗原最适包被浓度分别为1O.Oug/mL和15.0ug/mL；一抗血清和最适稀释度均为1：100；酶标二抗最适稀释度均为1：2000；一抗和二抗最适作用时间均分别为75min和45min。两种ELISA方法具有良好的特异性、敏感性、重复性。以不同比例的hexon、penton两种蛋白混合包被,建立hexon-penton-ELISA方法。用三种ELISA方法检测野毒感染和灭活苗免疫血清各30份,结果表明两种血清均有反应,hexon-penton-ELISA灵敏度更高。用三种ELISA方法检测临床样品100份,阳性率分别为45%、41%、48%。为FAVI抗体的检测和流行病学调查提供简便、快速的血清学诊断方法。以100K和33K非结构蛋白分别作为包被抗原,建立检测FAVI抗体的间接100K-ELISA和33K-ELISA方法。结果表明,抗原最适包被浓度分别为10.8u∥mL和12.0u∥mL；一抗血清最适稀释度均为1：100；酶标二抗最适稀释度均为1：3000；一抗和二抗最适作用时间均分别为60min和45min。两种方法具有良好的特异性、敏感性、重复性。以不同比例的100K、33K两种蛋白混合包被,建立间接100K-33K-ELISA方法。J1j三种ELISA方法检测野毒感染和灭活苘免疫I『n.消符30份,表明100K-33K-ELISA灵敏度更高。用三种ELISA方法检测临床样l ul 100份,15I…j率分别为40%、35%、42%。该方法可检出FAVI野毒感染血消,而与火活苘免疫血消无反应,为该病的诊断与净化提供技术支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 I群禽腺病毒的概况
• 1.1.1 I群禽腺病毒的分类
• 1.1.2 I群禽腺病毒的病原特征
• 1.1.3 I群禽腺病毒的理化与培养特性
• 1.1.4 I群禽腺病毒的流行病学
• 1.2 I群禽腺病毒的基因结构与蛋白
• 1.2.1 I群禽腺病毒的基因组特点
• 1.2.2 结构蛋白
• 1.2.3 非结构蛋白
• 1.3 I群禽腺病毒诊断技术研究进展
• 1.3.1 I群禽腺病毒的分离鉴定
• 1.3.2 I群禽腺病毒的血清学诊断方法
• 1.3.3 I群禽腺病毒的分子生物学诊断方法
• 1.4 ELISA鉴别诊断方法研究概况
• 1.4.1 ELISA原理
• 1.4.2 ELISA诊断方法种类
• 1.4.3 ELISA鉴别诊断
• 1.5 研究的目的和意义
• 第二章 I群禽腺病毒分离鉴定和hexon基因的克隆与序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 鸡胚、毒株和血清
• 2.1.2 受体菌、载体和主要试剂
• 2.1.3 病毒的分离
• 2.1.4 PCR鉴定
• 2.1.5 免疫琼脂扩散
• 2.1.6 血凝试验
• 2.1.7 鸡胚肝细胞的培养及细胞病变观察
• 2.1.8 形态学观察
• 2.1.9 鸡胚致病性试验
• 2.1.10 DNA提取与PCR扩增
• 2.1.11 克隆、测序和分析
• 2.1.12 TCID50的测定
• 2.1.13 中和试验
• 2.2 结果
• 2.2.1 病毒的分离与PCR鉴定结果
• 2.2.2 免疫琼脂扩散与血凝性
• 2.2.3 细胞病变观察
• 2.2.4 电镜负染观察
• 2.2.5 鸡胚致病性试验
• 2.2.6 PCR鉴定
• 2.2.7 hexon基因序列比较和遗传进化分析
• 50与中和试验结果'>2.2.8 TCID₅₀与中和试验结果
• 2.3 讨论
• 第三章 I群禽腺病毒hexon、penton结构蛋白和100K、33K非结构蛋白原核表达、纯化及鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 病毒、鸡胚、受体菌、血清
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 病毒DNA的提取
• 3.1.4 hexon、penton、100K和33K基因的PCR扩增
• 3.1.5 PCR产物的克隆
• 3.1.6 四种重组蛋白的表达及最佳诱导条件的探索
• 3.1.7 四种重组蛋白的可溶性鉴定
• 3.1.8 四种重组蛋白的纯化
• 3.1.9 四种重组蛋白浓度与纯度的分析
• 3.1.10 Western-blot检测
• 3.2 结果
• 3.2.1 四种基因的PCR扩增
• 3.2.2 克隆与测序结果
• 3.2.3 四种重组蛋白的表达结果
• 3.2.4 四种重组蛋白的可溶性鉴定
• 3.2.5 四种重组蛋白的纯化结果
• 3.2.6 四种重组蛋白的Western-blot结果
• 3.3 讨论
• 第四章 I群禽腺病毒E LISA鉴别诊断的研究
• 试验一 I群禽腺病毒hexon和penton结构蛋白作为ELISA诊断抗原的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 血清
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 hexon和penton蛋白作为ELISA检测抗原方法的建立
• 4.1.4 ELISA阴性、阳性临界值的确定
• 4.1.5 特异性试验
• 4.1.6 敏感性试验
• 4.1.7 重复性试验
• 4.1.8 hexon-penton-ELISA混合包被的摸索
• 4.1.9 临床样品检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 抗原最适包被浓度与血清最适稀释度的确定
• 4.2.2 抗原最佳包被条件的确定
• 4.2.3 最佳封闭液及封闭时间的确定
• 4.2.4 —抗血清和酶标二抗最适作用时间的确定
• 4.2.5 酶标二抗最佳浓度的确定
• 4.2.6 ELISA程序的确定
• 4.2.7 阴阳性判定标准的确定
• 4.2.8 特异性试验
• 4.2.9 敏感性试验
• 4.2.10 重复性试验
• 4.2.11 hexon-penton-ELISA混合包被的结果
• 4.2.12 临床样品检测
• 4.3 讨论
• 试验二 I群禽腺病毒100K和33K非结构蛋白作为ELISA鉴别诊断抗原的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 血清
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 间接ELISA方法
• 4.1.4 100K、33K包被抗原间接ELISA反应条件的确定
• 4.1.5 阴、阳性临界值的确定
• 4.1.6 特异性试验
• 4.1.7 敏感性试验
• 4.1.8 重复性试验
• 4.1.9 100K-33K-ELISA混合包被的结果
• 4.1.10 临床样品检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 间接ELISA反应条件的优化
• 4.2.2 ELISA程序的确定
• 4.2.3 阴、阳性判定标准的确定
• 4.2.4 特异性试验
• 4.2.5 敏感性试验
• 4.2.6 重复性试验
• 4.2.7 100K-33K-ELISA混合包被的结果
• 4.2.8 临床样品检测结果
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 个人简历
• 攻读学位期间发表论文情况