PTD-△NFATminiDBD融合蛋白的制备和生物学功能初步研究

论文摘要

目的:克隆人△NFATminiDBD基因,构建带PTD穿膜序列的原核表达载体,在体外表达并纯化、复性融合蛋白,初步研究其生物学功能。方法:利用重叠PCR技术构建含R466A/T533G两个突变位点的人NFAT 391到583位氨基酸最小DNA结合序列即△NFATminiDBD,并将其克隆至pMD18-T载体,进行双酶切鉴定及序列分析。将测序正确的人△NFATminiDBD基因克隆到带穿膜序列的pQE30a-PTD、pQE30a-PTD-eGFP原核表达载体及不带穿膜序列的pQE30a原核表达载体,并在工程菌E·Coli M15中表达,得到含6×His标签的融合蛋白;利用Bio-Rad公司的镍柱纯化融合蛋白,并进行蛋白复性。运用Western-blot技术检测融合蛋白表达的正确性,流式细胞术和Western-blot检测融合蛋白进入人T淋巴细胞瘤株Jurkat细胞的能力,经T细胞增殖抑制试验初步分析融合蛋白对T细胞增殖能力的调节。结果:成功构建了不具穿膜功能的pQE30a-△NFATminiDBD原核表达载体和具有穿膜功能的pQE30a-PTD-△NFATminiDBD、pQE30a-PTD-eGFP、pQE30a-PTD-△NFATminiDBD-eGFP原核表达载体,表达、纯化、复性了带6×His标签的上述融合蛋白。Western-blot证实了融合蛋白表达的准确性,流式细胞术和Western-blot分析证实PTD能携带融合蛋白有效的进入细胞内,T细胞增殖抑制试验证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力结论:成功表达了具有生物学活性并具有穿膜功能的融合蛋白PTD-△NFATminiDBD,初步的实验研究表明此融合蛋白能够进入细胞核,明显抑制T细胞的增殖,为进一步研究其免疫调节机制和今后的临床应用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 NFAT简介
• 1.1.1 NFAT家族成员及其结构
• 1.1.2 CaN结构
• 1.1.3 NFAT信号通路的活化过程
• 1.2 NFAT新型抑制剂的作用靶点和机制
• 1.3 PTD简介
• 1.4 本论文研究的目的、方法、试验方案的设计、意义
• 第二章 △NFATminiDBD的构建
• 2.1 材料方法
• 2.2 试验结果
• 2.3 讨论
• 第三章 PTD-△NFATminiDBD融合蛋白的表达、纯化及复性
• 3.1 材料方法
• 3.2 试验结果
• 3.3 讨论
• 第四章 PTD-△NFATminiDBD融合蛋白功能的初步研究
• 4.1 材料方法
• 4.2 试验结果
• 4.3 讨论
• 第五章 主要结论和展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读硕士期间发表的论文