排硫硫杆菌亚硫酸盐受体氧化还原酶的纯化和性质

论文摘要

从烟气生物脱硫系统的好氧产硫磁性稳态流化床反应器中取磁性多孔珠固定化生物膜,采用排硫硫杆菌培养基在好氧条件下富集、反复分离纯化获得分离菌,经过细菌、菌落形态的观察以及一系列生理生化指标,对应伯杰氏细菌鉴定手册,初步鉴定该分离菌为硫杆菌属（thiobacillus）的排硫硫杆菌（thiobacillus thioparus）。将分离纯化得到的排硫硫杆菌细胞超声波破碎、脱盐浓缩、DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-150分子排阻层析分离纯化得到亚硫酸盐受体氧化还原酶,并对其进行性质表征。光谱分析表明该酶除了在280nm外无其他特征吸收峰;SDS-PAGE结果显示该酶是一种αβ异二聚体,由分子量33.9KDa和42.2KDa的两个亚基构成;活力分析发现有92%的酶活存在于细胞膜部分,该酶属于膜蛋白。其最适pH为7.5,最适温度为40℃,在3-7.5较宽的pH范围内酶活力具有很好的稳定性,温度在3℃-50℃之间酶活力能保持在70%以上。该酶对亚硫酸钠的Vmax为22.15μM/min,Km为86.09μM;底物专一性强,该酶基本不受Na+、K+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+和Ba2+等金属离子的影响,EDTA和氢氧化钠对该酶有明显的抑制作用。其氧化产物为硫酸盐。对可能参与分离菌硫氧化代谢途径中的酶采用酶活分析方法进行了测定,并参考相关文献,提出了分离菌硫氧化代谢途径的可能模型。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 硫氧化细菌的研究概况
• 1.1.1 硫氧化细菌在自然界硫生物循环中的地位
• 1.1.2 硫氧化细菌的应用
• 1.1.3 硫氧化细菌的研究现状
• 1.2 硫杆菌的生物学特性
• 1.2.1 硫杆菌的概述
• 1.2.2 硫杆菌的分类学地位
• 1.2.3 硫杆菌的代谢机理研究
• 1.3 硫杆菌的酶学研究
• 1.3.1 亚硫酸盐受体氧化还原酶
• 1.3.2 硫氧化酶
• 1.3.3 硫代硫酸盐受体氧化还原酶
• 1.3.4 硫氰酸酶
• 1.3.5 硫代硫酸盐脱氢酶
• 1.3.6 连四硫酸盐水解酶
• 1.4 硫杆菌硫代谢途径的研究
• 1.4.1 单质硫的氧化
• 3^2-的氧化'>1.4.2 SO₃^2-的氧化
• 2O₃^2-的氧化'>1.4.3 S₂O₃^2-的氧化
• 1.4.4 连四硫酸盐的水解
• 1.4.5 硫杆菌硫氧化系统的可能模式
• 1.5 课题的提出及内容
• 2 实验部分
• 2.1 材料、试剂与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器和设备
• 2.1.3 生化试剂
• 2.2 菌种的分离纯化及鉴定
• 2.2.1 菌种的分离纯化及扩大培养
• 2.2.2 菌种的复筛和菌种的保藏
• 2.2.3 菌种鉴定
• 2.3 分离菌硫氧化系统模型
• 2.3.1 粗酶液的制备
• 2.3.2 分离菌内参与硫代谢途径的酶活力的测定
• 2.3.3 排硫硫杆菌的硫氧化模型
• 2.4 分离菌亚硫酸盐受体氧化还原酶的纯化及性质表征
• 2.4.1 分离菌的收集
• 2.4.2 粗酶液的制备
• 2.4.3 亚硫酸盐受体氧化还原酶的纯化
• 2.4.4 亚硫酸盐受体氧化还原酶的性质表征
• 3 实验结果与分析讨论
• 3.1 分离菌的纯化及鉴定
• 3.1.1 菌种的富集、分离、纯化
• 3.1.2 菌种保藏
• 3.1.3 菌种鉴定
• 3.2 分离菌硫氧化代谢途径模型
• 3.2.1 酶活力的测定结果分析
• 3.2.2 排硫硫杆菌的硫氧化代谢途径模型
• 3.3 亚硫酸盐受体氧化还原酶的分离纯化及性质表征
• 3.3.1 亚硫酸盐受体氧化还原酶位置确定
• 3.3.2 DEAE-52 纤维素离子交换层析
• 3.3.3 Sephadex G-150 凝胶过滤层析
• 3.3.4 亚硫酸盐受体氧化还原酶的提纯结果
• 3.3.5 亚硫酸盐受体氧化还原酶的纯度鉴定及分子量测定
• 3.3.6 亚硫酸盐受体氧化还原酶的的光谱性质
• 3.3.7 亚硫酸盐受体氧化还原酶的最适pH 和最适温度
• 3.3.8 亚硫酸盐受体氧化还原酶的热稳定性和酸碱稳定性
• 3.3.9 亚硫酸盐受体氧化还原酶的动力学性质
• 3.3.10 亚硫酸盐受体氧化还原酶的底物专一性分析
• 3.3.11 抑制剂对亚硫酸盐受体氧化还原酶的影响
• 3.3.12 各种离子对亚硫酸盐受体氧化还原酶的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢