聚合法制作猪嵌合胚胎初步研究

论文摘要

嵌合体是由两个或两个以上具有不同遗传性状的胚胎(细胞)结合在一起发育而成的个体。嵌合体的制作主要有囊胚注入法和聚合法两种。相比较而言,聚合法操作简单,但成功率较低,究其原因,主要是因为胚胎聚合是建立在发育相对同步化胚胎的基础上,而同时获得这种胚胎较为困难;另外,聚合过程中各个环节的技术性和操作性都很强,影响因素很多,比如透明带去除,胚胎聚合条件、聚合胚的培养液和培养环境等。近年来随着干细胞技术的快速发展和应用潜力的不断显现,通过个体间的胚胎嵌合技术获得具有组织相容性的胚胎干细胞,业已成为解决众多医学问题的有效途径,因此,同品种内不同个体间胚胎的相互嵌合已经成为汇聚该途径的焦点。然而,胚胎嵌合技术成功率低的问题严重地制约了这一技术领域的快速发展。本实验通过对嵌合技术主要环节,如透明带去除、聚合浓度选择、聚合胚胎发育时期选择、聚合体系建立以及培养方法创新等方面进行系统研究,探讨其对品种内个体间胚胎聚合法猪嵌合体制作的影响,旨在摸索出一套适宜的猪嵌合体胚胎制作程序,以提高聚合胚胎的发育率,延长聚合胚胎的发育阶段。研究结果如下: 1 猪嵌合胚制作中透明带去除研究 实验采用酸性台氏液、0.25%链霉蛋白酶液、0.3%链霉蛋白酶液、0.5%链霉蛋白酶液四种去除透明带液(以下简称去带液)对不同个体8细胞胚胎进行去除透明带处理,以获得的裸胚率、聚合率及聚合胚发育率为指标,判断四种去带液对胚胎聚合效果的影响。结果表明:在四个处理组中,获得裸胚率最高的是0.3%链霉蛋白酶液处理组(14/17,82.4%),差异显著(P<0.05):获得裸胚率最低的是酸性台氏液处理组(8.5/16,53.1%),差异显著(P<0.05):0.25%链霉蛋白酶液(9/13,69.2%)和0.3%链霉蛋白酶液处理组(10/14,71.4%)的聚合率显著高于酸性台氏液(5/8.5,53.1%)和0.5%链霉蛋白酶液处理组(7/11,63.6%)(P<0.05):0.259%链霉蛋白酶液(6/9,66.7%)和0.3%链霉蛋白酶液处理组(7/10,70.0%)聚合胚的发育率高于酸性台氏液(1/5,20.0%)和0.5%链霉蛋白酶液(3/7,42.9%),差异显著(P<0.05),酸性台氏液处理组的聚合胚的发育率显著低于其他三组(P<0.05)。由上可知,用0.3%的链霉蛋白酶处理对猪胚胎透明带进行处理时的效果较好,获得的裸胚率、聚合率和聚合胚发育率均较高。 2 猪胚胎聚合液浓度研究 实验通过观察三种浓度的植物凝集素(0.03%PHA、0.06%PHA、0.12%PHA)对猪胚胎聚合的处理情况,依据聚合率和聚合胚发育率判断不同PHA浓度对聚合效果的影响。结果表明:随着PHA浓度的升高,胚胎的聚合率逐渐增加,依次为:11/17(64.7%),12/16(75.0%),14/18(77.8%):而0.06%PHA处理组的聚合胚发育率(9/12,75.0%)显著高于0.03%PH～7/11,63.6%)和0.12%PHA处理组(9/14,64.3%)(P<0.05)。故为得到较高的聚合率和聚合胚的发育率,制作猪嵌合胚时应选用0.06%PHA进行胚胎的聚合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 哺乳动物嵌合体的研究历史及研究进展
• 1.1 国外嵌合体研究
• 1.2 国内嵌合体研究
• 1.3 猪嵌合体研究
• 2 哺乳动物嵌合体制作原理
• 2.1 细胞识别和细胞粘着
• 2.2 与胚胎发育相关的细胞粘着分子
• 2.3 凝集素（lectin）
• 3 嵌合体的制作方法
• 3.1 囊胚注入法
• 3.2 聚合法
• 4 聚合法制作嵌合体
• 4.1 胚胎的获得
• 4.2 透明带的去除和卵裂球的获取
• 4.3 聚合
• 4.4 聚合胚的体外培养
• 4.5 嵌合体的鉴定
• 5 嵌合体制作的影响因素
• 5.1 胚胎对嵌合体制作的影响
• 5.2 非胚胎因素
• 6 哺乳动物嵌合休制作技术的应用前景
• 6.1 生物学价值
• 6.2 医学价值
• 6.3 经济价值
• 7 哺乳动物嵌合体研究的存在问题
• 7.1 种间限制
• 7.2 胚胎干细胞和畸胎瘤细胞
• 7.3 嵌合体的鉴定（嵌合体标记）
• 7.4 种系嵌合率低
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 操作液
• 1.3 方法
• 1.4 实验设计
• 1.5 评判标准的确定及数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同去带液对猪胚胎聚合效果的影响
• 2.2 不同PHA浓度对猪胚胎聚合效果的影响
• 2.3 不同发育时期对猪胚胎聚合效果的影响
• 2.4 不同聚合体系对猪胚胎聚合效果的影响
• 2.5 凹窝培养对猪聚合胚发育的影响
• 3 讨论
• 3.1 不同去带液对猪胚胎聚合效果的影响
• 3.2 不同PHA浓度对猪胚胎聚合效果的影响
• 3.3 不同发育时期对猪胚胎聚合效果的影响
• 3.4 不同聚合体系对猪胚胎聚合效果的影响
• 3.5 凹窝培养对猪聚合胚发育的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表文章