论文摘要
目的（1）建立一种基因芯片方法,用于检测恶性疟原虫抗药性分子标志。共涉及21个SNP,包括:恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因（pfcrt）的391 T/A、392G/C、399 G/T、400 A/G、402 T/A和404 A/C多态性（对应第72～76位氨基酸编码序列,与氯喹和氨酚喹抗性有关）;恶性疟原虫多药抗性基因（pfmdrl）的256A/T和257 A/T多态性（对应第86位氨基酸编码序列,与甲氟喹和苯芴醇等多种药物抗性有关）;恶性疟原虫二氢喋酸合成酶基因（pfdhps）的1482 T/G、1483C/T/G、1486 G/C、1794 A/G、1918 C/G和2013 G/T/A多态性（对应第436、437、540、581和613位氨基酸编码序列,与磺胺类药物抗性有关）;恶性疟原虫二氢叶酸还原酶基因（pfdhfr）的148 T/C、152 A/T、153 T/C、175 T/C、323 G/A/C和490A/T多态性（对应第50、51、59、108和164位氨基酸编码序列,与乙胺嘧啶抗性有关）;恶性疟原虫三磷酸腺苷酶6基因（pfATPase6）的2306 G/A多态性(对应第769位氨基酸编码序列,与青蒿素类药物IC50升高有关)。（2）评价芯片检测方法的准确性、灵敏度、特异性、稳定性和检材适用性;考查其对混合感染及各种已知基因型的检测能力;估算芯片检测方法所需的时间和费用。（3）应用建立的芯片方法检测我国云南省、海南省和缅甸禅邦现场恶性疟原虫的抗药性分子标志,从分子水平了解上述地区恶性疟原虫的药物抗性态势。方法（1）根据NCBI网站中恶性疟原虫抗药性相关基因的参考序列,针对各抗药性相关多态性位点,应用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0和Array Designer 2.0软件包,设计多态性检测探针和对照探针,采用接触式点样法制备芯片。建立多重PCR方法,扩增5个基因目的片段,再以DNase I对扩增产物进行片段化,并作Cy3标记。标记后的产物与芯片上探针杂交,激光扫描杂交结果,依据荧光信号值判定待测标本基因型。通过检测基因型已知的5份实验室虫株（预先采用巢式PCR结合测序方法检测）,调整探针,摸索和优化芯片杂交反应条件。（2）检测不同稀释度FCC1/HN分离株基因组DNA,评价芯片灵敏度;检测30份现场标本,与测序结果比较,评价芯片准确性;检测间日疟原虫、伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、杜氏利什曼原虫和牛源隐孢子虫,评价芯片特异性;比较同一张芯片内的三次平行检测结果和同一标本的两次独立检测结果,评价芯片稳定性;检测恶性疟原虫3D7株DNA依次与Dd2株、FCC1/HN分离株、CMH/YN分离株DNA的混合样品,考查芯片对混合感染标本的检测能力;人工合成37条50 bp的寡核苷酸（oligo）,对其20种不同组合进行芯片检测,确认芯片能检出已报道的各种可能基因型;检测已保存5年的滤纸血样和已保存3年的DNA,评价芯片检材适用性;计算芯片检测所需时间和费用。（3）以滤纸干血滴方式从我国海南省、云南省和缅甸禅邦收集恶性疟原虫标本,采用Chelex 100煮沸法提取基因组DNA,多重PCR扩增后,应用芯片检测方法分析现场标本抗药性分子标志。对多重PCR扩增失败的标本,先进行全基因组扩增,再作多重PCR扩增和芯片检测。结果（1）经反复调整,最终确定了11组45条特异性芯片检测探针和5条对照探针序列;优化的芯片反应条件为:探针点样浓度25μmol/L、杂交温度52℃、杂交时间2 h;在优化后的反应条件下,5份实验室标本的芯片检测结果与测序结果一致。（2）30份现场标本除2份未能成功检测外,其余28份标本的308（28×11）组探针中的301组探针（97.7%）获得可用信号,其中6组探针检测结果与测序结果不一致;满足芯片检测要求基因组DNA的阈值为60 pg;同一张芯片内的三次平行检测和同一标本的两次独立检测结果一致率分别为97.3%和95.7%;5份其他虫种经芯片检测,特异性探针均未见阳性信号:芯片对3份模拟混合感染标本的检测结果与实际情况相符;芯片可检出干燥条件下保存5年的滤纸血样和保存3年的基因组DNA;整个检测过程约需8 h,每检一个SNP约需人民币2.9元。（3）芯片检测了采白海南、云南和缅甸禅邦的92份现场标本,其中14份标本第一次多重PCR扩增失败;进行全基因组扩增后,14份中的6份标本成功完成芯片检测,共获得84份芯片检测结果,部分标本存在1到2个位点无法检测。三地现场标本pfcrt 72-76位氨基酸基因型均以CVIET为主,76位氨基酸的突变率分别为52.6%、92.1%和100.0%,差异有统计学意义（x2=21.57,P＜0.01）;pfmdrl 86位氨基酸的突变率依次为10.5%、12.5%和8.3%,差异无统计学意义（x2=0.27,P=0.87）;pfdhfr50、51、59、108和164位氨基酸平均突变个数云南高于缅甸和海南（P＜0.01）,而缅甸和海南之间差异无统计学意义。pfdhps 436、437、540、581和613位氨基酸平均突变个数云南高于海南,P=0.03,其余各组间差异无统计学意义;三地均未发现pfATPase6 769位氨基酸突变型;三地恶性疟原虫平均抗药性相关突变个数分别为5.21、8.32和7.00,差异有统计学意义（F=11.41,P＜0.01）,进一步两两比较发现,云南和缅甸现场标本突变数高于海南（P值分别为＜0.01和=0.04）,云南与缅甸之间差异无统计学意义（P=0.09）。结论（1）本研究成功建立一种基因芯片方法,实现一次反应完成5个基因21个抗药性相关SNP的检测。（2）该方法灵敏、特异,检测结果准确、可靠,较传统方法节约时间和成本,提高了恶性疟原虫抗药性分子标志的检测效率。该方法限于检测已明确的抗药性相关基因多态性,不能检测pfmdrl基因拷贝数这一分子标志。（3）应用芯片方法完成了中国海南省、云南省及缅甸禅邦现场恶性疟原虫抗药性分子标志的检测。结果发现我国云南省和缅甸禅邦恶性疟原虫药物抗性总体态势较海南省更为严峻;氯喹、乙胺嘧啶和磺胺类药物虽已较长时间停止使用,但这些药物的敏感性尚未充分恢复;三地均未检出与青蒿素类药物敏感性下降有关的pfATPase6 769位氨基酸突变。
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