论文摘要
第一章RASSF1A和DAPK基因启动子在RB中的甲基化状态目的研究肿瘤抑制基因RAS相关区域家族1A（Ras-Association domainfamily 1,isoform A,RASSF1A）和死亡相关蛋白激酶（Death-Association-Protein-Kinase,DAPK）基因启动子在视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）组织和患者外周血中的甲基化状态。方法应用甲基化特异性PCR（methylated-specific polymerase chainreaction,MSP）技术检测28例视网膜母细胞瘤组织和9例RB患者外周血中RASSF1A和DAPK基因启动子的甲基化状态,并分别比较各组间甲基化率的差异。结果1.RB组织中RASSF1A基因启动子的甲基化率为60.7%（17/28）,高于正常人视网膜组织或瘤旁组织,差异有显著的统计学意义（P＜0.01）。2.单侧RB组织的甲基化率为72.7%（16/22）高于双侧16.7%（1/6）,差异有统计学意义（P=0.022）。3.2例（2/9）RB患者外周血中检测到RASSF1A基因启动子的高甲基化,而5例（0/5）健康志愿者外周血中均未发生甲基化,两者相比较甲基化差异无统计学意义。4.DAPK基因启动子在RB组织及患者外周血中均未发生甲基化。结论RASSF1A基因启动子高甲基化是RB中一常见频发的表观遗传修饰。第二章5-Aza-CdR对RB细胞RASSF1A基因启动子去甲基化的转录调节作用目的研究5-氮杂2-脱氧胞苷（5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR）对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞株RASSF1A基因启动子去甲基化转录调节作用的量效和时效关系。方法将人视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞,随机分组:A组:实验对照组（0.0125%DMSO组）;依5-Aza-CdR不同作用浓度分为以下5组:B:0.1μmol/l组;C:0.5μmol/l组;D:1.0μmol/l组;E:5.0μmol/l组;F:10.0μmol/l组,于4d后,应用MSP方法检测不同浓度作用后RASSF1A启动子甲基化状态的差异;应用RT-PCR方法检测不同时间点（1-7天）完全去甲基化的5.0μmol/l浓度药物作用时RASSF1AmRNA的表达差异;应用细胞免疫化学法检测RASSF1A蛋白的表达情况。结果1.在0.5μmol/l-5.0μmol/l浓度范围内,随着药物浓度的增加,RASSF1A甲基化产物电泳条带的光密度值（OD）逐渐降低,未甲基化产物的OD值逐渐增高并达高峰,各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。2.经5.0μmol/l 5-Aza-CdR作用5天后,沉默表达的RASSF1AmRNA重新表达并明显高于实验对照组和第1、2、3、4天（P＜0.05）。3.经5.0μmol/l 5-Aza-CdR作用5d后,RASSF1A蛋白阳性表达,而实验对照组不表达。结论1.视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞株中RASSF1A启动子呈甲基化状态,RASSF1A蛋白表达沉默。2.5-Aza-CdR在0.5μmol/l-5.0μmol/l浓度范围内可以逆转RASSF1A基因启动子的甲基化状态,呈浓度依赖性,在5.0μmol/l浓度作用5d后可以恢复该基因稳定的再次表达。3.RASSF1A基因启动子高甲基化可能成为RB肿瘤治疗的有效靶点。第三章5-Aza-CdR抑制体外培养的RB细胞的生长目的观察5-Aza-CdR对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞株的生物学行为影响,探索RB肿瘤治疗的新方法。方法实验分组同前,5-Aza-CdR干预后,应用MTT比色法检测各时间点（24h、48h、72h、96h、120h、144h）各组细胞吸光度值（A）绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测各时间点各组细胞生长周期及凋亡的变化。结果1.细胞增殖的变化:经5.0μmol/l 5-Aza-CdR诱导96h后,HXO-RB44细胞增殖减少,细胞生长速度明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。2.细胞生长周期和凋亡的变化:5.0μmol/l 5-Aza-CdR诱导96h、144h后G0/G1期细胞比例增加,同时细胞凋亡率也增高,与实验对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论5-Aza-CdR通过阻滞HXO-RB44细胞生长周期于G0/G1期并促进其凋亡而抑制细胞生长。
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