有机磷农药多残留ELISA方法探讨

论文摘要

现有的农药多残留检测方法主要是气相色谱和高效液相色谱等仪器分析法,这些方法前处理步骤复杂,费时费力、设备昂贵,且需要专业人员操作,适宜实验室检测,但不适宜大量样品和现场快速检测。酶联免疫检测方法快速、灵敏、选择性好,适宜痕量物质的检测,同时还具有检测成本低,操作简便,安全可靠等优点。利用单克隆抗体及免疫检测技术,探索有机磷农药多残留免疫检测方法,可以为农药多残留快速检测试剂盒的开发应用提供理论依据。研究方法:利用有机合成方法将有机磷农药小分子与蛋白相连,从而制得免疫原和包被原;用合成的免疫原免疫小鼠,通过细胞培养、克隆化培养等无菌操作技术制备有机磷农药的单克隆抗体;建立检测单种农药残留的ELISA方法并验证其灵敏度、检测限、特异性、回收率及与色谱方法的差异;在单残留检测的基础上,探索食品中有机磷农药多残留的免疫检测方法。结果主要包括以下几方面:1.以毒死蜱原药和3-巯基丙酸为起始原料,通过亲核取代反应等步骤,合成了毒死蜱半抗原,再通过碳化二亚胺法与BSA、OVA反应,制备了免疫原和包被原,偶联比为20:1,符合小分子免疫的要求,从之后的实验结果也能证实此抗原合成是成功的。甲胺磷结构本身自带氨基,所以直接采用EDC法与BSA、OVA连接,但从后面的免疫、单抗制备试验发现此抗原合成方法并不理想。2.免疫毒死蜱抗原的小鼠效价可达到2 104倍,可以用于细胞融合试验;免疫甲胺磷抗原的小鼠中部分小鼠效价达104倍以上,可以进行细胞融合实验。经细胞融合技术成功建立了2株能稳定分泌抗毒死蜱单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2E4和4B9,经纯化后,获得了高纯度的单克隆抗体,用紫外分光光度法测得其含量为1.5mg/mL。对其进行抗体亚类鉴定,鉴定结果为IgG1。而分泌甲胺磷抗体的杂交瘤细胞在培养过程中阳性逐渐消失,最终没有得到甲胺磷单克隆抗体。3.利用间接竞争ELISA方法建立了检测毒死蜱单残留的标准抑制曲线,回归方程为y=0.2322x+0.4391,回归系数R2=0.9988,毒死蜱与其特异性单克隆抗体竞争性结合的半数抑制浓度IC50为1.45μg/mL,该检测法的检出限为0.027μg/mL。与甲基毒死蜱有交叉反应性,与其他6种农药无交叉反应,芦笋样品经简单前处理后分别采用ELISA和GC测定,用ELISA方法测得芦笋中毒死蜱的添加回收率为82.6%98.96%,与GC测定结果基本相当。4.多残留试验结果显示对硫磷与毒死蜱没有交叉反应,且将两种农药混合包被后测单种农药残留结果与两种农药的标准检测曲线一致。但测两种农药多残留总量的方法还需进一步改进。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 前言
• 1.1 农药残留及其危害
• 1.1.1 我国农药的生产和使用概况
• 1.1.2 农药残留现状
• 1.1.3 农药残留的危害
• 1.2 多残留酶联免疫检测技术研究进展
• 1.2.1 多残留检测技术种类及其研究进展
• 1.2.2 酶联免疫检测技术研究进展
• 1.2.3 酶联免疫法检测药物多残留的研究进展
• 1.3 研究目的意义及内容
• 1.3.1 研究目的意义
• 1.3.2 研究内容
• 1.3.3 技术路线
• 第二章 有机磷农药毒死蜱、甲胺磷人工抗原的合成与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂及主要仪器
• 2.1.2 毒死蜱半抗原的合成及鉴定
• 2.1.3 毒死蜱完全抗原的制备和鉴定
• 2.1.4 甲胺磷完全抗原的制备和鉴定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 毒死蜱半抗原鉴定结果
• 2.2.2 毒死蜱完全抗原紫外鉴定结果
• 2.2.3 毒死蜱完全抗原偶联比的计算
• 2.2.4 甲胺磷完全抗原紫外鉴定结果
• 2.2.5 甲胺磷完全抗原偶联比计算
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 有机磷农药毒死蜱、甲胺磷单克隆抗体的制备与鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂及主要仪器
• 3.1.2 动物免疫
• 3.1.3 间接 ELISA 法检测小鼠免疫效价
• 3.1.4 细胞培养准备工作
• 3.1.5 杂交瘤细胞株建立
• 3.1.6 单抗大量制备
• 3.1.7 单抗纯化
• 3.1.8 抗体鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 酶标二抗最佳稀释度确定
• 3.2.2 小鼠效价测定
• 3.2.3 杂交瘤细胞株建立
• 3.2.4 抗体鉴定
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 毒死蜱残留 ELISA 方法研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂及主要仪器
• 4.1.2 建立检测标准曲线
• 4.1.3 确立最佳工作条件
• 4.1.4 特异性试验
• 4.1.5 回收率及其与 GC 方法比较
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 最佳工作条件确立
• 4.2.2 标准曲线
• 4.2.3 特异性试验
• 4.2.4 添加回收试验
• 4.3 小结与讨论
• 第五章 测定有机磷农药多残留间接竞争 ELISA 方法条件摸索
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试剂及主要仪器
• 5.1.2 多残留间接竞争 ELISA 最佳工作条件摸索
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 最佳工作条件确立
• 5.2.2 8 组试验结果
• 5.3 小结与讨论
• 第六章 全文主要结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历