霍乱弧菌调控aphB的基因筛选及功能研究及铜绿假单胞菌对霍乱弧菌抑制作用研究

论文摘要

霍乱是一种急性腹泻疾病,由革兰氏阴性细菌霍乱弧菌（Vibrio cholerae）引起。通常是血清群01群的古典型和埃尔托生物型霍乱弧菌致病,临床表现为大量米泔样大便,严重时候导致病人产生霍乱肌无力并且迅速脱水。如果迅速和适当的治疗没有跟进,可导致病人死亡。毒素协同调节菌毛（the toxin-coregulated pilus, TCP）是霍乱感染中的重要毒力因子,能协助霍乱弧菌定殖于小肠。霍乱弧菌产生的霍乱毒素（cholera toxin, CT）则导致病人剧烈腹泻。负责合成TCP的基因以操纵子的方式位于霍乱弧菌基因组中一个大毒力岛上,被称做TCP-ACF元件或霍乱毒力岛（vibrio pathogenicit island,VPI）.CT毒素是由ctxA和ctxB两个基因编码,它们位于另一个遗传元件原性噬菌体CTXΦ上。而位于霍乱毒力岛上的ToxT是AraC型调控子,能直接激活tcp,ctxAB和其他辅助定殖因子的表达。ToxT的表达则是依赖于两组基因的合作,包括大染色体上的跨膜调控蛋白编码基因toxRS和霍乱毒力岛上的tcpPH。而AphB与AphA协同作用可以激活tcpPH的表达,同时也是导致两大霍乱致病型古典型和埃尔托生物型毒力基因表达差异的原因。霍乱弧菌有三套平行的群体感应系统,共同调控霍乱毒力基因表达。研究证明,霍乱弧菌群体感应系统通过关键调控蛋白HapR负调控毒力基因的表达.HapR通过直接作用于aphA的启动子区调控毒力级联系统,降低毒力的表达。但是HapR并不影响aphB的表达。为了研究aphB的表达调控机理,我们利用转座子插入突变建库的方法进行筛选。我们将aphB启动子区克隆到两个报告质粒pBBRLux和pKP302上,并将其导入埃尔托生物型霍乱弧菌C6706（lacZ-）中,以此作为出发菌株。利用出发菌株与转座子pSC123接合建库,通过检测aphB启动子的表达水平来筛选影响aphB表达的突变株。在本研究中,我们筛选到两株突变株T1和T2能影响aphB的表达。运用随机扩增PCR方法检测转座子插入位点,通过测序比对分析后发现T1中转座子插入在vc1585读码框内,而T2中转座子则插入在距vc1602基因末端7bp处。通过分别构建框内缺失株,我们确定vc1585能够影响aphB的表达,而vc1602及vc1601单缺失并不影响aphB的表达。在另一个实验中我们拟筛选能够抑制霍乱弧菌C6706生长的细菌。经过筛选我们发现了十株细菌能显著抑制霍乱弧菌的生长。经API20E试纸条鉴定,发现十株菌均为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。通过与铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853对比发现可能是绿脓素（Pyocyanin, PCN）在抑菌过程中起主要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 1 霍乱弧菌毒力因子及致病机理
• 1.1 霍乱弧菌的主要毒力因子
• 1.2 毒力基因表达调控网络
• 2 霍乱弧菌群体感应系统及环境生存
• 2.1 霍乱弧菌群体感应
• 2.2 霍乱弧菌环境生存
• 3 霍乱弧菌LysR转录调控因子
• 3.1 LysR类转录调控因子的研究进展
• 3.2 LTTRs的主要特征
• 3.3 LTTRs的结构与调控模式
• 3.4 霍乱AphB蛋白
• 参考文献
• 第一章 霍乱弧菌aphB调控基因的筛选及相关研究
• 第一节 霍乱弧菌aphB调控基因的筛选及鉴定
• 1. 材料与方法
• 2 结果和分析
• 3 小结和讨论
• 第二节 vc1585及vc1602对aphB的调控作用
• 1. 材料与方法
• 2 结果和分析
• 3 小结与讨论
• 参考文献
• 第二章 霍乱弧菌拮抗菌筛选及机制研究
• 第一节 霍乱弧菌拮抗菌的筛选
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 小结与讨论
• 第二节 绿脓素对霍乱弧菌的抑菌作用
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 小结与讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录一 PFGE中所用试剂
• 附录二 符号与缩略语说明
• 致谢