异黄酮合成酶基因无标记转化番茄的研究

论文摘要

目前,因为转化效率的问题,大多数植物遗传转化操作需要使用选择标记基因,诸如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子,虽然仍无直接研究结果表明选择标记基因影响人类健康或环境安全,但近年来人们对转基因食品安全性的担心却与日俱增,为了消除转基因食品的安全性顾虑,无选择标记转基因植物应运而生。本文初步对Cre/lox重组系统进行了研究,并用已构建好的能有效删除标记基因的Cre/loxp组成型载体利用农杆菌介导转化烟草,获得了共转化烟草植株;植物异黄酮是一类具有增强植物抗病、诱导根瘤形成以及预防激素相关肿瘤发生、缓解女性更年期综合症的活性次生代谢产物,其合成关键酶是异黄酮合酶（IFS）;本研究为了改良加工番茄的品质特性,使人们在食用加工番茄产品的同时获得更好的保健效果,对加工番茄遗传转化的再生体系进行了优化,构建了含有IFS基因的植物表达载体pBI121-ifs,并用根癌农杆菌介导转化加工番茄子叶且获得了转基因植株;果树由于自身的特点,使得遗传转化有很大的难度和特殊性。所以本文以草莓和苹果为试材,建立了适用于草莓和苹果转基因的高效遗传转化体系。本研究的主要结论如下:1.本试验对获得的22株共转化烟草叶片提取DNA进行PCR检测,结果证明有10株成功删除了gus基因,删除率为45.5%;2.农杆菌介导转化加工番茄时筛选出的最适宜培养基:预培养培养基是MS+B5+IAA1.0mg/L+6-BA2.0mg/L,筛选转化苗培养基为MS+B5+IAA1.0mg/L+6-BA2.0 mg/L+Cef500mg/L+Kan50mg/L ,转化苗生根培养基为l/2MS+B5+IBA2.0mg/L+ Cef300mg/L+Kan50mg/L,对获得的11株转化加工番茄提取DNA和RNA进行PCR和RT-PCR检测,结果证明有4株已经成功转入了ifs基因,转化效率为36.4%;3.草莓离体再生体系建立中筛选的最佳培养基:茎尖快繁培养基l/2MS+B5+NAA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L,不定芽诱导培养基MS+B5+NAA0.3mg/L+TDZ3.0 mg/L;苹果离体再生体系建立中筛选的最佳培养基:茎尖快繁培养基为l/2MS+B5+NAA0.2mg/L+6-BA 1.0 mg/L ,不定芽诱导培养基为MS+B5+ NAA0.1mg/L+ZT1.0 mg/L。上述研究可为今后进一步获得安全性的转基因果实奠定一定的技术基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 进展
• 1.1.1 根癌农杆菌介导的番茄遗传转化研究进展
• 1.1.2 异黄酮合成酶（IFS）基因的研究
• 1.1.3 获得无标记转基因植物的研究
• 1.1.4 草莓离体再生以及农杆菌介导转化的研究进展
• 1.1.5 苹果离体再生以及农杆菌介导转化的研究进展
• 1.2 本课题研究的目的与意义
• 1.2.1 无标记转基因加工番茄的研究
• 1.2.2 草莓和苹果高效再生遗传转化体系的建立
• 第二章 根癌农杆菌介导的加工番茄遗传转化再生体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 消毒剂种类和消毒时间对消毒效果的影响
• 2.2.2 子叶苗龄以及外植体切割大小和接种密度
• 2.2.3 生芽培养基激素组合筛选
• 2.2.4 生根培养基激素组合筛选
• 2.2.5 卡那霉素质量浓度试验（附图Ⅲ）
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于农杆菌介导番茄转化效率的影响因素
• 2.3.2 关于加工番茄子叶芽的再生
• 2.3.3 关于卡那霉素的使用质量浓度
• 第三章 CRE/LOX 重组系统介导转基因烟草中GUS 的删除效率测定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 共转化植株的PCR 分析
• 3.2.2 NPTⅡ基因的序列分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 删除效率问题
• 第四章 IFS 基因的克隆与植物表达载体构建以及转化加工番茄
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 IFS 基因的克隆
• 4.2.2 重组质粒的筛选和鉴定
• 4.2.3 IFS 基因的序列分析
• 4.2.4 转基因植株的PCR 检测
• 4.2.5 转基因植株的RT-PCR 检测
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 4.3.2 酶切效率的影响因素
• 4.3.3 连接反应
• 4.3.4 IFS 基因的转化
• 4.3.5 转基因植株的生长
• 4.3.6 转化植株的PCR 鉴定的可靠性
• 第五章 草莓以及苹果高效再生体系的建立
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 草莓茎尖快繁培养基配比
• 5.2.2 草莓不同培养基配比对叶片再生不定芽的诱导（萘乙酸0.05、0.1、0.2、0.3、0.4.0.5.0.6 MG/L）
• 5.2.3 苹果茎尖外植体建立
• 5.2.4 叶盘法对苹果不定芽的培养
• 5.3 讨论
• 5.3.1 无菌苗快速繁殖代数对果树的影响
• 5.3.2 不同激素对果树叶盘再生的影响
• 5.3.3 离体培养过程中愈伤组织状态分化不定芽的潜力
• 5.3.4 基因型差异
• 5.3.6 外植体的处理方法
• 5.3.7 培养条件
• 第六章 结论
• 6.1 IFS 基因转化加工番茄
• 6.2 CRE/LOXP 系统转化烟草
• 6.3 草莓的再生体系建立
• 6.4 苹果的再生体系建立
• 参考文献
• 附录：主要生化试剂和转基因用试剂的来源和配制
• 附图
• 致谢
• 个人简历
• 导师评阅表