论文摘要
检测细胞内蛋白质之间的相互作用对于理解生命的活动过程有重要的意义。目前已经有许多技术被开发并用于体内蛋白质相互作用的检测,如酵母双杂交技术,荧光共振能量转移技术及蛋白质片段互补技术等,但是这些技术各有优缺点。近年来发展的双分子荧光互补技术（BiFC）正在被广泛应用于体内蛋白质相互作用研究。该技术基于如下原理:荧光蛋白被切成两个肽段后,每个肽段不能被激发发射荧光,也不能自发组装成完整的荧光蛋白从而被激发产生荧光,但是当两个片段分别融合于相互作用的两个蛋白时,在相互作用蛋白的辅助下能重新组建成完整的荧光蛋白,从而被激发产生荧光。BiFC技术具有简单,快速,直观,灵敏及定位等特点,然而迄今存在的BiFC系统的特征光谱较短（≤570 nm）,本研究将波长较长（587/610 nm）的第二代红色单体荧光蛋白mCherry发展成一个新的BiFC系统,扩展了BiFC技术的波谱范围。根据mCherry的晶体结构,将mCherry分别从3个氨基酸位点（136/137,159/160,174/175）切开,用EGFP作为弱相互作用蛋白筛选出从位点159/160切开所形成的两个片段能够产生BiFC信号,发展了基于mCherry的BiFC系统。用已知相互作用的一组蛋白（SV40的大T抗原（LTag）和人源p53）作为研究对象,验证了mCherry-BiFC系统在细胞内研究蛋白质相互作用的可靠性。本研究亦引入Venus-BiFC系统,将mCherry-BiFC和Venus-BiFC在细胞内共用同时检测两组蛋白质的相互作用（LTag和p53及早幼粒细胞白血病蛋白（PML）和sp100）,结果表明mCherry-BiFC系统和其他BiFC系统可以共用,能够用于检测多个蛋白之间的相互作用。由于mCherry较强的亮度,较短的成熟时间（T1/2≈25 min）,较长的激发和发射波长,使得本研究所发展的mCherry-BiFC系统成为一个很好的体内蛋白质相互作用研究工具,并能和其他BiFC系统共用,同时研究体内多个蛋白间的相互作用。