豆豉溶栓酶的表达、复性、纯化及其药理学研究

论文题目: 豆豉溶栓酶的表达、复性、纯化及其药理学研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 张仁怀

导师: 张义正

关键词: 豆豉溶栓酶,基因表达,大肠杆菌,毕赤酵母,前肽,复性,硫氧还蛋白,金属螯和亲和层析,纯化,药理学,溶栓作用,急性毒性

文献来源: 四川大学

发表年度: 2005

论文摘要: 为了探讨豆豉溶栓酶（Douchi Fibrinolytic Enzyme,subtilisin DFE）前肽的功能,并在大肠杆菌（Escherichia coli）中高效表达豆豉溶栓酶,优化豆豉溶栓酶的复性条件和提高豆豉溶栓酶的纯化得率,本研究共构建了4种表达质粒。将豆豉溶栓酶全编码序列（pre-pro-DFE）克隆到pET29a中,表达产物pre-pro-DFE主要以包涵体形式存在于破菌后的沉淀中,破菌上清中未检测到成熟的豆豉溶栓酶,说明pre-pro-DFE没有发生正确的复性和切割。将豆豉溶栓酶前肽—成熟肽编码序列（pro-DFE）克隆到pET32a中,豆豉溶栓酶与硫氧还蛋白以Trx-pro-DFE形式融合表达时,表达产物主要以Trx-pro-DFE形式存在于包涵体中,破菌上清中含有成熟的豆豉溶栓酶,有很强的溶栓酶活性。将豆豉溶栓酶成熟肽编码序列克隆到pET32a中,豆豉溶栓酶与硫氧还蛋白以Trx-DFE形式融合表达,表达产物以Trx-DFE形式同时存在于包涵体和破菌上清中,但破菌上清中未检测到成熟的豆豉溶栓酶,也无溶栓酶活性。 通过对不同缓冲液的透析和用不同缓冲液稀释进行复性时发现,变性的pre-pro-DFE、Trx-pro-DFE及hisTrx-pro-DFE可以通过透析和稀释复性,而不含前肽的Trx-DFE则不能,证明前肽对豆豉溶栓酶的正确折叠与切割是必需的。变性Trx-pro-DFE通过透析或稀释复性时,溶液澄清,复性效率高,其中透析复性优于稀释复性,而透析的优选缓冲液为0.5mol/L（NH4）2SO4,20mmol/LTris-HCl（pH8.0）。当变性pre-pro-DFE通过透析或稀释复性时,溶液混浊,大部分pre-pro-DFE以沉淀形式析出,复性效率低。这些结果说明,硫氧还蛋白可

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第一章 豆豉溶栓酶基因在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 试剂

2.2 菌株及载体

2.3 培养基

2.4 实验方法

3 结果

3.1 豆豉溶栓酶基因表达质粒的构建和鉴定

3.2 重组蛋白的诱导表达

3.3 重组豆豉溶栓酶的纯化

3.4 重组豆豉溶栓酶的性质研究

4 讨论

4.1 大肠杆菌表达系统对豆豉溶栓酶基因表达的影响

4.2 豆豉溶栓酶基因的结构对其表达产物活性的影响

4.3 重组豆豉溶栓酶的纯化

小结

参考文献

第二章 重组豆豉溶栓酶的复性及其纯化

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 试剂及菌株

2.2 实验方法

3 结果

3.1 豆豉溶栓酶融合蛋白的诱导表达及其包涵体的制备

3.2 稀释和透析复性

3.3 金属螯和亲和层析复性

3.4 rDFE的层析复性及纯化

3.5 rDFE的鉴定及其性质研究

4 讨论

4.1 rDFE的透析和稀释复性

4.2 rDFE的Ni~(2+)螯和亲和层析复性

4.3 rDFE的变性复性工艺

4.4 rDFE的纯化效果

4.5 rDFE的鉴定及其性质研究

小结

参考文献

第三章 豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 菌株与载体

2.2 工具酶及试剂

2.3 培养基

2.4 实验方法

3 结果

3.1 豆豉溶栓酶基因的扩增与克隆

3.2 毕赤酵母转化及转化子的鉴定

3.3 豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达

3.4 重组豆豉溶栓酶的纯化

3.5 重组豆豉溶栓酶性质研究

4 讨论

4.1 豆豉溶栓酶在毕赤酵母中的表达

4.2 毕赤酵母表达的重组豆豉溶栓酶的纯化

4.3 豆豉溶栓酶的不同表达与纯化方法比较

小结

参考文献

第四章 豆豉溶栓酶的初步药理学研究

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 药品

2.2 动物

2.3 豆豉溶栓酶制剂的制备

2.4 豆豉溶栓酶溶栓活性测定

2.5 豆豉溶栓酶急性毒性试验方法

2.6 豆豉溶栓酶药效学初步实验

2.7 药理学实验指标的检测

3 结果

3.1 豆豉溶栓酶样品制备及其溶栓酶活性检测

3.2 豆豉溶栓酶急性毒性试验

3.3 豆豉溶栓酶药效学初步实验

4 讨论

小结

参考文献

文献综述 以包涵体形式表达的重组蛋白的复性

摘要

1 包涵体的形成和基本特性

1.1 包涵体的定义、组成与特性

1.2 包涵体的形成

1.3 包涵体表达的有利因素

2 变性蛋白复性的研究

2.1 包涵体分离、洗涤及溶解

2.2 蛋白质复性机制研究

2.3 包涵体蛋白复性方法

2.4 包涵体蛋白复性效率

2.5 复性效果的检测

3 复性后样品处理

参考文献

致谢

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发布时间: 2006-05-12

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