自噬相关基因Beclin-1原核表达载体的构建及其在前列腺癌中的表达研究

论文摘要

前列腺癌（prostate cancer,PCa）是一种老年男性的疾病,随着社会的进步,前列腺癌已经成为危及男性健康的另一大肿瘤疾病。但是目前的医疗水平,早期不易检出前列腺癌,而且易误诊为前列腺良性疾病,确诊时基本已是中晚期,这时前列腺癌已经行之有效的治疗方法。随着肿瘤治疗水平的提高,出现了很多新的治疗方法,其中自噬（autophagy）便是其中一个研究热点。Beclin-1是一种自噬相关基因,与肿瘤细胞的自噬作用密切相关。本课题构建了Beclin-1原核表达载体,并初步明确了Beclin-1在前列腺癌细胞和前列腺癌组织中的表达情况,为以后的实验工作奠定了基础。1、自噬相关基因Beclin-1原核表达载体的构建从GenBank中检索出Beclin-1基因的DNA序列后,利用引物设计软件Primer 5.0设计含有BamHⅠ和HindIII酶切位点的针对Beclin-1编码区全基因的特异性引物。然后提取前列腺癌细胞系LNCaP的总RNA,将总RNA反转录为cDNA,并以cDNA作为模板,利用PCR技术扩增出Beclin-1全编码基因片段,长为1353bp。然后将此基因克隆入pQE-80载体中,酶切鉴定并送公司测序,测序结果与GenBank中的Beclin-1基因序列同源性为100%,重组表达载体pQE-80L-Beclin-1构建成功。2、自噬相关基因BECLIN-1在前列腺癌细胞及组织中的表达利用GenBank中检索出的Beclin-1基因的DNA序列,用Primer5.0设计出针对Beclin-1部分片段的引物,目的条带大约为750bp。同时,设计参照基因GAPDH的特异性引物,长度约为250bp。将铺满瓶底的前列腺癌细胞系以及对照细胞QZG收集,提取细胞总RNA后反转录为cDNA,-20℃保存。将cDNA定量后,取个细胞系相同量的cDNA作为模板,并将GAPDH作为参照基因,利用PCR扩增出目的条带和参照基因,观察Beclin-1 mRNA的表达差异情况。RT-PCR的结果显示Beclin-1 mRNA在前列腺癌细胞系及肺癌细胞系A549表达均是下降的。将铺满瓶底的各细胞系收集并提取各细胞系的总蛋白,将蛋白进行定量后,取相同量的蛋白做Western-blot观察各细胞系中Beclin-1蛋白的表达情况。结果显示各癌细胞系的Beclin-1蛋白相对于正常肝细胞系QZG来说,表达量均下降。将个细胞系做细胞爬片,利用免疫细胞化学染色的方法从形态学上观察前列腺癌细胞中的Beclin-1蛋白的表达情况,结果表明,前列腺癌细胞中Beclin-1蛋白的表达量下降。将前列腺癌组织芯片利用免疫组织化学染色的方法来观察前列腺癌组织中Beclin-1蛋白的表达情况,结果显示,相对于正常的前列腺组织来说,不同分级的前列腺癌组织其Beclin-1蛋白的表达量均是下降的。以上结果表明,在前列腺癌中自噬相关基因Beclin-1的表达是下降的,推测其与已报道的前列腺癌细胞自噬作用降低有关,这为以Beclin-1为靶点的前列腺癌治疗策略奠定了实验依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 一、前列腺癌现状
• 二、自噬通路及研究现状
• 三、自噬相关基因 Beclin-1 的研究现状
• 四、自噬在肿瘤治疗中的作用
• 五、针对自噬信号通路的肿瘤靶向治疗
• 第一部分 自噬相关基因BECLIN-1 原核表达载体的构建
• 引言
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第二部分 自噬相关基因BECLIN-1 在前列腺癌细胞和组织中的表达-
• 1 试验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢