抗猪传染性胃肠炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

论文摘要

分别用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达的重组猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）S蛋白和含有猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因主要抗原位点的重组质粒PCI-Sa免疫BALB／c小鼠，按常规方法进行细胞融合。间接ELISA方法进行筛选，前者筛选抗原为TGEV细胞培养物上清；后者筛选抗原为纯化的乳酸乳球菌表达重组TGEV S蛋白。采用有限稀释法，经过三次克隆，最终前者获得两株抗TGEV S蛋白的杂交瘤细胞株（C7C882和B5G8G7）；后者获得一株抗TGEV S蛋白的杂交瘤细胞株（E6D9A12）。三株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类分别为IgM、IgM、IgG2a类，杂交瘤细胞体外长期培养和冻存均不影响抗体的分泌。杂交瘤细胞的平均染色体数为88±10对，用相应的筛选抗原经间接ELISA检测C7C882、B5G8G7、E6D9A12细胞培养上清的抗体效价分别为1：200、1：100、1：500，腹水抗体效价分别为1：2×105、1：1×104、1：6×105。以猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PRV）、猪伪狂犬病病毒（PrV）细胞培养物上清液为抗原，与三株杂交瘤细胞上清经间接ELISA检测结果显示，这三株单抗与TGEV显示良好的特异性，而与PEDV、PRV和PrV不存在交叉反应。说明获得的单抗具有高度的特异性。用实验获得的单克隆抗体和SP2／0细胞培养上清对感染TGEV的ST细胞培养物进行了间接免疫荧光检测病原的比较研究：间接免疫荧光染色后，与单抗作用的细胞培养物中，多数细胞在其胞浆和细胞膜上出现黄绿色闪亮荧光，且荧光强度强，与SP2／0细胞培养上清作用的细胞培养物未见有黄绿色闪亮荧光，结果表明，利用所制备的抗TGEV S蛋白的单克隆抗体进行间接免疫荧光对病原检测具有较高的特异性。以纯化的TGEV为抗原，Dot-ELISA检测实验获得的单克隆抗体与TGEV的反应性，结果三株杂交瘤细胞上清与TGEV反应均出现灰色印记，可判定为阳性；与SP2／0细胞上清反应为阴性。证明单克隆抗体与TGEV具有特异性反应。上述实验结果均表明，所制备的抗TGEV S蛋白的单克隆抗体对病原检测具有较强的特异性，为TGEV病原特性的基础性研究和病原的快速检测提供了重要的物质基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 TGEV的基本生物学特征
• 1.2 TGEV的蛋白及功能
• 1.2.1 非结构蛋白
• 1.2.2 结构蛋白
• 1.3 猪传染性胃肠炎诊断及诊断试剂研究进展
• 1.3.1 传统的诊断方法
• 1.3.2 分子生物学诊断方法
• 1.4 猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的研究进展
• 1.5 本课题研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞与病毒
• 2.1.2 质粒与菌株
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 重组TGEV S蛋白的真核表达与纯化
• 2.2.2 重组质粒PCI-Sa的大量提取
• 2.2.3 实验动物的免疫
• 2.2.4 筛选抗原的提取
• 2.2.5 间接ELISA检测方法的建立
• 2.2.6 杂交瘤细胞系的建立
• 2.2.7 单克隆抗体的特性鉴定
• 2.2.8 杂交瘤细胞系的鉴定
• 3 结果
• 3.1 重组TGEV S蛋白的真核表达与纯化结果
• 3.2 重组TGEV S蛋白的乳酸乳球菌表达与纯化
• 3.3 ELISA筛选方法的建立
• 3.3.1 TGEV抗原与真核表达蛋白免疫小鼠的血清最佳反应条件
• 3.3.2 乳酸乳球菌表达蛋白与重组质粒免疫的小鼠血清最佳反应条件
• 3.4 杂交瘤细胞系的建立
• 3.4.1 细胞的融合率
• 3.4.2 阳性杂交瘤细胞的筛选与建立
• 3.5 单克隆抗体及杂交瘤细胞系的鉴定
• 3.5.1 单克隆抗体的鉴定
• 3.5.2 杂交瘤细胞系的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 关于制备单克隆抗体不同免疫原的选择
• 4.2 关于制备单克隆抗体筛选抗原的选择
• 4.3 关于TGEV S蛋白单克隆抗体的特性
• 4.4 抗TGEV S蛋白单克隆抗体的应用前景
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文