脂肪干细胞的分离培养及向神经元诱导过程中肌动蛋白的表达

论文摘要

背景与目的：干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞又可分为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞（adult stem cells，ASCs）。胚胎干细胞是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性和巨大的医学应用潜力，其在中枢神经系统疾病的细胞移植治疗方面的运用已经获得了一定的疗效，但围绕该研究的伦理道德问题也随之出现，严重阻碍了其发展及应用。神经干细胞属于成体干细胞，其发现开辟了神经修复的新纪元。但是，人类神经干细胞主要来源于流产胚胎，其有限的来源及伦理学争议也使其应用受到了很大的限制。因此，寻找新的干细胞来源，具有重要的意义。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新的能力及多向分化的潜能。适宜的体内或体外环境下，间充质干细胞具有分化为多种中胚层组织的能力，甚至还具有跨胚层分化为神经外胚层组织的潜能，且其伦理问题大为减少，是细胞移植和组织工程的新型种子细胞，具有广阔的应用前景。但是骨髓MSCs必须通过侵入的途经获得，脐血、羊膜等组织所得到的细胞数量十份有限。所以，寻找更易获得、含量丰富且易于培养的MSCs新来源，对MSCs的试验研究和临床应用，具有重要意义。脂肪组织来源丰富并且易于获得，脂肪组织中干细胞含量远高于骨髓中干细胞的含量，脂肪干细胞可以作为人干细胞库的重要来源，是理想的组织工程种子细胞，有重要的研究和应用价值。本研究通过对SD大鼠腹股沟脂肪组织中MSCs的分离、培养，体外诱导分化，生物学特性观察，以探讨脂肪来源的MSCs在体外培养、诱导的方法以及在分化为神经元细胞的过程中肌动蛋白的表达，为进一步研究和应用脂肪组织来源干细胞奠定基础。方法：细胞培养：健康成年Sprague—Dawley（SD）大鼠腹腔过量麻醉处死，无菌条件下取出腹股沟处脂肪组织，用加入双抗的PBS缓冲液（PBS缓冲液／100 U／L的青霉素／100 mg／mL的链霉素）反复冲洗，而后眼科剪于安培瓶中充分剪碎脂肪组织，加入0.1％的Ⅰ型胶原酶于37℃振荡箱内消化60min，加入PBS缓冲液稀释，筛网过滤，1200 g离心10 min，去上清，加入低糖DMEM培养基（培养基中加有10％的FBS，2mmol／L的L—谷氨酰胺）重悬细胞，并移入50ml一次性塑料培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱中孵育，72 h后换培养液（培养液为低糖DMEM／10％的FBS／2mmol／L的L—谷氨酰胺），去除未贴壁的悬浮细胞。随后每2～3天换液，约1周后细胞达80％～90％融合时，0.25％胰蛋白酶消化，传代。向神经细胞诱导及免疫组化：第5代的脂肪MSCs达80％～90％融合时，低糖DMEM培养基重悬细胞，吹打均匀后以微量可调移液器等量种植于细胞培养板中（各个细胞培养板内放置经L-多聚赖氨酸包被的消毒盖玻片）。待细胞达到60—70％左右融合时，加入预诱导剂（低糖DMEM培养基／10％FBS／10ug／ml碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）），培养24小时观察细胞形态。取其中一细胞爬片进行神经巢蛋白（nestin）免疫荧光染色，其余更换为诱导剂（低糖DMEM培养基／2％，5％，10％二甲基亚砜（DMSO）／6mmol／Lb—巯基乙醇（BME））诱导，诱导3小时、5小时、7小时后分别取出细胞爬片终止生长，进行肌动蛋白（ACTIN）免疫细胞化学染色，神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经巢蛋白（nestin）免疫荧光染色。结果：接种后24h内，经Ⅰ型胶原酶消化从腹股沟脂肪组织中分离的体积较大的细胞多数已贴壁并开始伸展；大部分呈梭行，也有的呈圆型或多角形。72小时左右在相差显微镜中已可观察到开始分裂增值的细胞，形状呈较规则的梭型，有粗大突起伸出，核居中，有的可看到1-2个核仁。一周后，显微镜下可见大量的成纤维样细胞成单层生长并且排列具有一定的方向性。细胞接种时，培养物中混有大量的红细胞，随培养时间的延长，这些红细胞随换液次数的增多而被清除。约1周后细胞达80％～90％融合时以1：3传代，传代后第一天，即可见细胞呈梭样改变，第3—4天铺满瓶壁。传至三代后，细胞形态均匀，呈长梭样；培养五代后，细胞仍呈长梭样，并且增生活跃。体外培养8—10代后，细胞的增值速度明显减慢，细胞较前宽大，甚至不再增值。经低糖DMEM培养基／10％FBS／10ug／ml bFGF预诱导，可见相当一部分细胞成nestin免疫荧光染色阳性，提示有神经前体细胞生成。诱导24h后更换为DMEM培养基／2％，5％，10％DMSO／6mmol／LBME诱导，3小时、5小时、7小时nestin阳性细胞逐渐减少，而NSE阳性的神经元样细胞则大量增加。诱导3小时、5小时、7小时后进行肌动蛋白（ACTIN）免疫细胞化学染色，可见脂肪MSCs定向分化为神经元的过程中，分化3h后，细胞体积较小，突起较短，阳性反应物分布于细胞核及胞质中，分化5、7h后，随着细胞的生长，ACTIN蛋白在胞浆及突起均呈阳性表达，并随着突起的伸展而不断延伸，且可见突起内有阳性表达物直达突起末端。证明肌动蛋白的表达对定向分化的神经元的生长和发育起着重要作用。结论：1．用Ⅰ型胶原酶成功地从Sprague—Dawley大鼠腹股沟处脂肪组织中分离和培养了MSCs，脂肪MSCs可以在含10％的FBS和2mmol／L的L—谷氨酰胺的低糖DMEM培养基中进行体外增殖。2．脂肪MSCs经bFGF预诱导后可有神经前体细胞的生成，这些细胞今后可能分化为神经细胞。3．经bFGF预诱导后的脂肪MSCs，再经DMSO、BME诱导，能够分化为神经元样细胞。4．肌动蛋白的表达对神经元在定向分化中的生长和发育起着重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 第三章 结果
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢