论文摘要
化学合成塑料的产生给人类的生活带来了极大的便利，但其生物难降解性也带来了严重的白色污染，同时其原材料—石油资源也日益紧缺。因此，化学合成塑料的替代品—可降解塑料的研究与开发就显得越来越重要。聚羟基脂肪酸酯（PHA）作为一种具有广阔应用前景的石油基塑料的替代品，目前已成为国内外研究的热点之一。PHA是微生物在营养不均衡的条件下合成的一种胞内酯类物质。由于PHA的生物可降解性、无毒且环境友好等特点，被广泛应用于众多领域，如环境、生物医学、造纸、电子、光学等。就目前PHA研究状况而言，获得高产、高转化率的微生物菌株仍然是聚羟基脂肪酸酯生产及应用的关键。本文通过对自然界土样进行微生物的筛选，成功地获得一株聚羟基脂肪酸酯生产菌，通过16S rDNA序列测定及系统发育分析等分子生物学鉴定手段，最终将其命名为Rhizobium sp. H2-5。随后我们对菌株Rhizobium sp. H2-5进行了发酵营养条件优化，以提高其PHA提取率；并分析了不同发酵方式对菌株Rhizobium sp. H2-5的PHA提取率的影响，扩大了PHA生产菌株资源。本文主要研究内容和结果如下：1.聚羟基脂肪酸酯产生菌的筛选及鉴定。从自然界中取样，经过尼罗蓝荧光平板初筛、苏丹黑染色复筛，成功筛选出一株聚羟基脂肪酸酯产生菌H2-5。提取菌株H2-5胞内产物进行红外光谱分析以及元素分析，最后证实菌株H2-5胞内提取物为聚羟基脂肪酸酯。随后我们提取菌株H2-5的基因组DNA进行16S rDNA序列测定及blast比对，结果表明菌株H2-5属于根瘤菌属，并将其命名为Rhizobiumsp. H2-5。形态学特征显示：H2-5菌体呈杆状，革兰氏染色呈阴性，不产芽孢。在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落呈圆形，表面光滑，大小均一，边缘整齐，菌落呈淡黄色，半透明。菌株H2-5生理生化实验结果表明：菌株H2-5不能水解淀粉作为碳源，也不能利用柠檬酸盐，甲基红实验与V.P实验均成阴性，生长过程中不产生硫化氢，在形成芽孢的培养基上（淡薄培养基）生长良好，但不产生芽孢。生长曲线结果表明：菌株的适应期很短，接种3h后就进入对数期，接种18h左右就达到稳定期，所以菌株H2-5有适应期短，生长快速的特点。2.菌株Rhizobium sp. H2-5发酵条件的优化。首先通过单因素实验确定了菌株Rhizobium sp.H2-5发酵培养基组成及发酵条件，结果显示最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨。我们从中选出4个对PHA提取率有较大影响的因素，分别为发酵培养基初始pH、发酵温度、接种量以及碳氮比。通过对这4个参数的四因素三水平的正交实验及SPSS统计学分析，确定最佳发酵条件为发酵培养基初始pH为7.0，发酵温度30℃，发酵时间为39h，装液量为100mL/500mL三角瓶，接种量为4%，碳氮比为100/4。对以上得出的最佳条件进行摇瓶验证，结果与正交实验结论相近。其PHA的产量可达到细胞干重的50%以上，PHA提取率较优化前提高了20%-22%。3.菌株Rhizobium sp. H2-5发酵过程控制研究。在发酵时间为24h和39h时，向培养基中补加12.5g/L的氯化铵溶液。结果表明补料发酵方式可以在一定程度上提高菌体浓度和PHA提取率，但提高量不能达到工业规模化生产的要求。采用分步发酵法首先将菌株Rhizobium sp. H2-5接种至富氮培养基中，培养36h后收集菌体直接投入到贫氮发酵培养基中进行发酵。结果表明，两步发酵法生产聚羟基脂肪酸酯可以同时获得较高的菌体浓度和PHA提取率。