论文摘要
目的:胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一,也是最易发生腹腔种植转移的恶性肿瘤,目前手术切除仍然是治疗胃癌最有效的方法。近年来,由于微创外科的发展,特别是其创伤小、出血少、术后恢复快等微创特点使其逐步深入腹部外科的各个领域。腹腔镜结直肠癌手术已经被证实具有与开腹手术相当甚至优于开腹手术的早期和远期疗效。但由于腹腔镜胃癌手术开展较晚,随机对照研究病例较少,目前尚处于探索阶段。在这一背景下,西南医院普通外科于2004年成立微创胃肠外科中心,系统研究腹腔镜胃癌根治术的技术方法和临床应用可行性。本研究一方面从临床病例入手,通过检测腹腔镜胃癌根治术对腹腔脱落胃癌细胞和腹膜超微结构的影响,探讨腹腔镜手术是否会促进胃癌细胞的脱落和种植。另一方面,我们于体外建立人工气腹模型,设立不同种类、不同压力气腹环境,通过对气腹环境下胃癌细胞增殖活性、细胞周期、凋亡比例、迁移运动、细胞骨架以及裸鼠移植瘤的研究,探讨CO2气腹对胃癌细胞生物学特性和侵袭转移能力的影响。最后,检测不同压力CO2气腹下胃癌细胞细胞周期蛋白和凋亡相关基因的表达变化,对其分子机制进行初步探讨。方法:（1）收集同期开展的腹腔镜胃癌和开腹胃癌手术病人腹腔冲洗液,应用细胞学和荧光定量PCR法检测腹腔脱落游离癌细胞和CEA mRNA。再获取腹腔镜胃癌和开腹胃癌手术病人腹膜和胃浆膜标本,常规固定制样,扫描电镜观察其超微结构改变。（2）建立体外人工气腹模型,分别以CO2和混合气体作为膨腹介质,设定压力为0、10、12和15mmHg。分别应用MTT酶标仪、流式细胞仪、Boyden小室和免疫荧光激光共聚焦显微镜检测不同种类、不同压力气腹环境对胃癌MKN-45细胞增殖活性、细胞周期、凋亡比例、迁移运动和细胞骨架的影响。（3）将不同种类、不同压力环境下培养的MKN-45细胞接种于裸鼠皮下,观察裸鼠移植瘤成瘤时间、肿瘤大小和Ki-67表达变化。（4）分别应用RT-PCR、Western-blot、免疫沉淀、免疫组化方法检测不同压力CO2气腹对胃癌MKN-45细胞Cyclin D1、CDK4、Rb、磷酸化Rb、Bcl-2/Bax以及Cyclin D1和CDK4结合能力的影响。结果:（1）腹腔镜胃癌根治术组和开腹胃癌根治术组腹腔游离胃癌细胞的检出率和CEA mRNA阳性率无显著差异（P>0.05）;腹腔游离癌细胞检出率与肿瘤浸润深度、浆膜受侵面积、淋巴结转移和TNM分期密切相关。腹腔镜胃癌根治术组腹膜间皮细胞肿胀、细胞间隙增宽,而开腹胃癌根治术组腹膜间皮细胞形态无明显改变、细胞间连接紧密。两组胃浆膜超微结构无显著差异。（2） CO2气腹组胃癌MKN-45细胞培养液pH值下降非常显著,且压力越大pH值降低越明显。混合气体组胃癌MKN-45细胞培养液pH值与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。（3） 0、10、12、15mmHg混合气体气腹组和0、10、12 mmHg CO2气腹组与对照组比较增殖活性无显著性差异（P>0.05）,15mmHg CO2气腹组增殖活性在前3天无显著性差异,在47天下降非常显著（P<0.01）。15mmHg CO2气腹组胃癌MKN-45细胞增殖指数与对照组比较显著下降（P<0.05）,凋亡比例增加非常显著（P<0.01）,而0、10、12 mmHg CO2气腹组和0、10、12、15mmHg混合气体气腹组与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。（4） 15mmHg CO2气腹组胃癌MKN-45细胞穿过滤膜数量与对照组比较显著下降（P<0.01）,F-actin表达明显减少,结构松散,微管蛋白β-tubulin表达较对照组减弱、稀疏。而0、10、12 mmHg CO2气腹组和0、10、12、15mmHg混合气体气腹组与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。（5） 15mmHg CO2气腹组胃癌MKN-45细胞Cyclin D1、CDK4在mRNA和蛋白水平均显著下降（P<0.05）,二者结合能力也显著下降（P<0.05）。Rb蛋白在mRNA和蛋白水平与对照组比较无显著性差异（P>0.05）,但磷酸化Rb蛋白则显著低于对照组（P<0.05）。免疫组化染色显示Bcl-2/Bax表达在15mmHg CO2气腹组明显低于对照组和0、10、12 mmHg CO2气腹组（P<0.05）。（6） 15mmHg CO2气腹组裸鼠移植瘤体积、重量、Ki-67阳性率与对照组比较显著下降（P<0.05）,0、10、12 mmHg CO2气腹组和0、10、12、15mmHg混合气体气腹组与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。结论:（1）腹腔镜胃癌根治术与开腹胃癌根治术比较并不增加腹腔游离胃癌细胞的检出率,腹腔游离胃癌细胞检出率与肿瘤浸润深度、浆膜受侵面积、淋巴结转移和TNM分期密切相关。（2）腹腔镜胃癌根治术CO2气腹对壁层腹膜影响较大,主要表现在间皮细胞肿胀、细胞间连接断裂、细胞间隙增宽、基底层组织暴露,而对胃壁浆膜影响较小。（3） 0、10、12mmHg CO2气腹和0、10、12、15mmHg混合气体气腹对胃癌MKN-45细胞增殖活性、增殖指数凋亡比例的影响与对照组比较无显著差异。15mmHg CO2气腹显著降低胃癌MKN-45细胞的增殖活性、增殖指数,增加其凋亡比例。（4） 15mmHg CO2气腹抑制胃癌MKN-45细胞的迁移运动能力。在15mmHg CO2气腹环境下胃癌MKN-45细胞的微丝微管表达减弱、结构松散、排列混乱,这可能是其运动能力减弱的因素之一。（5） 0、10、12mmHg CO2气腹和0、10、12、15mmHg混合气体气腹对胃癌MKN-45细胞裸鼠移植瘤成瘤时间、肿瘤体积、肿瘤重量无显著影响,而15mmHg CO2气腹可以显著延长裸鼠移植瘤成瘤时间,抑制肿瘤体积和重量。同时,15mmHg CO2气腹组裸鼠移植瘤Ki-67表达较对照组显著下降。（6） 0、10、12mmHg CO2气腹组胃癌MKN-45细胞Cyclin D1、CDK4、磷酸化Rb、Bcl-2/Bax以及Cyclin D1/CDK4结合能力与对照组比较无显著变化,15mmHg CO2气腹下调Cyclin D1、CDK4、磷酸化Rb和Bcl-2/Bax的表达,抑制Cyclin D1/CDK4结合能力。
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