论文摘要
目的:CD2相关蛋白（CD2-associated protein, CD2AP）的表达下降是导致肾小球硬化的原因之一。本实验的主要目的是构建E2F1真核表达质粒,探讨转录因子E2F1对人CD2相关蛋白表达的转录调控及其作用机制。方法:以人胚肾293（HEK293）细胞基因组DNA为模板,采用聚合酶联反应（polymerase chain reaction, PCR）技术扩增出E2F1片段,并克隆进真核载体pcDNA3.1（+）内,构建含E2F1基因的重组真核表达质粒。利用Western blot与逆转录聚合酶联反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）方法测定E2F1对人CD2AP蛋白及mRNA的影响;用过表达、RNA干扰及点突变方法确定E2F1对启动子的调控作用;用染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecitation, ChIP）技术,确定E2F1与CD2AP启动子的结合。结果:核酸序列分析及Western blot结果显示正确构建了含E2F1基因的重组真核表达质粒。过表达E2F1可增加人CD2AP蛋白与mRNA在HEK293细胞中的表达量。CD2AP启动子序列的荧光素酶表达质粒与pcDNA3-E2F1过表达共转染HEK293细胞后,可以增加人CD2AP启动活性并呈剂量依赖性增加;同时,与pU6-E2F1 shRNA共转染敲低E2F1则降低了CD2AP启动子活性。染色体免疫沉淀实验证实过表达E2F1能增加转录因子E2F1与人CD2AP启动子的结合,并减少转录因子Sp1与启动子的结合,但不改变Sp1蛋白的表达。对人CD2AP启动子区的四个Sp1位点逐个突变,突变质粒与pcDNA3-E2F1质粒共转染后显示突变Sp1C位点后启动子区对E2F1无反应。结论:在HEK293细胞中转录因子E2F1可在转录水平调节CD2AP表达,此调节作用是通过转录因子E2F1与CD2AP启动子区Sp1C位点结合并激活其启动子活性。