丹参酮IIA对小鼠脑血管内皮细胞内皮素系统的影响

论文摘要

目的脑的微循环障碍,血脑屏障的破坏是脑水肿的重要机制,内皮素（ET）是迄今为止所知的最强的长效缩血管物质,它参与了脑水肿的发生,发展的过程,它促进了血脑屏障的破坏。所以以内皮素为作用靶点,改善脑创伤后脑血流动力学,减少血管痉挛,保护血管调节功能应是临床脑水肿治疗的重要方法之一,中药丹参作为活血化瘀药物已经广为人熟知,它能够保护脑血管内皮细胞,维护血脑屏障,促进微循环,它们已广泛用于临床各种类型脑水肿的治疗,临床上已得到比较确定的疗效,但基础实验有关其疗效及其具体保护血脑屏障机制的研究还较少,本实验观察了在常规甘露醇治疗的基础上结合使用丹参酮IIA对大鼠冷冻所致脑水肿的影响。在此基础上,通过TNF—α诱导小鼠脑血管内皮细胞产生ET-1,通过该模型进而探讨丹参酮IIA对内皮素系统的影响,从而进一步阐明丹参酮IIA作用脑血管的机制。方法第一部分:（1）wistar成年大鼠80只,雌雄不限,随机分为4组,A（正常对照组）:未冷冻未治疗。给予生理盐水腹腔注射10ml/kg;B:（手术对照组）,冷冻后未进行任何治疗:每天予生理盐水腹腔注射10ml/kg;C:（甘露醇治疗组）,大鼠尾静脉滴注20%甘露醇10ml/kg;D（甘露醇+丹参酮IIA治疗组）,在同C组相同的治疗方案基础上每24小时分给予尾静脉注射丹参酮IIA注射液25mg/kg;（2）脑水肿模型:wistar成年大鼠,用直径圆形铜探针置于硬膜上,液氮冷冻60s,制成脑水肿模型。（3）神经功能评分:所有大鼠治疗24小时,48小时,72小时,一周后行神经功能缺损观察,采用改良的Zea-Longa量表进行评分。（4）光镜及电镜观察:于冷冻灶周边取1mm的脑片,置入固定液中,送透射电子显微镜室观察标本的超微结构。（5）脑含水量测定:每组分别于24小时,48小时,72小时,一周后随机取6只断头处死,开颅取脑,用滤纸轻吸去表面水分,装于精称过的称量瓶中,标记并称湿重,置烘箱105℃烘至恒重,两次称量差不超过0.0006g,干湿法测定组织含水量,按Eiliott公式计算脑含水量。脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%（6）甲酰胺法测定EB含量:采用改进Young氏改良法提取大鼠左右半球干脑组织的伊文氏蓝,然后在分光光度仪上测定含量。右半球伊文氏蓝增量=右半球伊文氏蓝量-左半球伊文氏蓝量。第二部分:（1）大鼠冷冻后72小时后,眼底取血4ml,肝素钠抗凝,送辽宁省中医学院药理实验室,用FASCOW全自动血液流变检测仪检测。（2）内皮素含量测定:采用放射免方法（RIA）,各组分别于24小时,48小时,72小时,一周后,用玻璃毛细管眼底取血,加入10%EDTA二钠30ul和抑肽酶40ul,混匀,采用非平衡法按试剂盒说明书操作计算血浆内皮素含量。第三部分:（1）细胞毒性测定MTT法测定:各组分别取细胞悬液加入MTT溶液（MTT 5mg/ml）20μl,充分溶解于DMSO,选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,取平均值。按以下公式计算细胞存活率:细胞存活率=实验组光吸收OD值/对照组光吸收OD值×100%。（2）培养液ET,大ET测定:放射免疫法测定,收集标本后根据放射免疫试剂盒有关说明进行。（3）根据有关文献设计ET-1,ECE-1,ETA,ETB引物,提取细胞RNA,测定提取总RNA的含量及纯度检测,逆转录PCR扩增,PCR产物电泳,对DNA条带进行检测和图像分析。（3）ET结合力测定细胞清洗匀浆处理后,取离心沉淀的细胞膜蛋白,投放125I-ET-1,丹参酮IIA等进行竞争抑制,测定细胞对125I-ET-1结合率,探讨丹参酮IIA是否影响ET-1和受体的结合。结果第一部分:（1）各治疗组与模型组对照,神经功能缺陷评分显著降低（P＜0.05或P＜0.01）,神经功能均显著改善。（2）经过甘露醇,丹参酮IIA联合治疗后,血脑屏障的破坏程度减轻,神经元,内皮细胞以及都保持正常结构,紧密连接结构正常。（3）脑组织含水量和EB含量变化:各治疗组术后24小时,48小时,72小时,一周后脑组织水含量均有显著性下降（P＜0.01）,结合丹参治疗组同C组相比,脑组织含水量均降低,有显著差异（P＜0.01或P＜0.05）。第二部分:（1）D组血液粘度高切,低切均明显降低,与模型组有显著差异（P＜0.05）,D组和C组差异无显著性（P＞0.05）。（2）大鼠冻伤后血浆ET含量持续增加,较正常组明显增高,甘露醇治疗组,丹参酮IIA+甘露醇治疗组,均较模型组显著降低,其中丹参酮IIA+甘露醇治疗组降低更为明显,单独的甘露醇治疗对血浆的ET-1没有显著改变。第三部分（1）丹参酮IIA对细胞存活率的影响:不同浓度的丹参酮IIA对脑血管内皮细胞的存活率没有影响,当丹参酮IIA浓度达到10ug/ml,20ug/ml时,TNF-α（5ug/ml）作用脑血管内皮细胞时细胞存活率相比较,有显著性差异。（2）丹参酮IIA对ET含量的影响:丹参酮IIA呈剂量依赖性降低培养液中ET含量,TNF-α使脑血管内皮细胞大ET含量明显减少,而作用丹参酮IIA后,培养液中大ET含量随着丹参酮IIA浓度的增加而升高。（3）TNF-α使脑血管内皮细胞ECE-1mRNA表达明显升高,10ug/ml.20ug/ml的丹参酮IIA使ECE-1mRNA表达明显降低。TNF-α作用脑血管内皮细胞后,其ETmRNA表达明显升高但是和单独TNF-α作用脑血管内皮细胞后相比,不同浓度丹参酮IIA处理后脑血管内皮细胞的ETmRNA的表达并没有明显变化。TNF-α明显增强脑血管内皮细胞ETAmRNA表达,但是对ETBmRNA表达呈相反的作用,当丹参酮IIA浓度达到10ug/ml,20ug/ml时,ETAmRNA表达明显降低,不同浓度的丹参酮IIA使ETBmRNA表达明显增高。（4）不同浓度丹参酮IIA作用后,脑血管内皮细胞ET和其受体的结合力并没有明显差异,与单独TNF-α（5ug/ml）作用脑血管内皮细胞相比无明显变化。结论（1）丹参酮IIA能够降低脑组织含水量,降低血脑屏障通透性,显著改善脑水肿程度。其机制可能在于丹参酮IIA能够显著降低脑水肿后血浆内皮素含量,改善脑血管微循环。（2）在体外TNF-a诱导的脑血管内皮细胞中,丹参酮IIA可能通过抑制内皮素转换酶的生成降低ET的含量。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果
• 讨论
• 论文二
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 论文三
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 四、本研究创新性自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研究成绩
• 致谢
• 个人简介