锌指蛋白A20在炎症性肠病发病机制中的作用

论文摘要

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（crohn’s disease, CD）,其病因与发病机制尚未完全明确。临床流行病学资料证实儿童炎症性肠病的发病率呈增高趋势。据报道,儿童克罗恩病的发病率约为0.2-8.5/10万,儿童溃疡性结肠炎的发病率约为0.5-4.3/10万。儿童期罹患炎症性肠病可导致生长发育迟缓和青春期的延迟,再加上长期的慢性腹痛、腹泻,严重影响患儿的心理和社会功能,研究资料显示IBD患儿健康相关生活质量显著低于正常儿童。与成人不同的是,儿童生活环境中的干扰因素相对较少（比如吸烟、避孕药的使用）,基因和肠道菌群在儿童炎症性肠病发病机制中可能起着更为重要的作用,因此儿童IBD患者更适合于炎症性肠病发病机制的研究。炎症性肠病,尤其是克罗恩病,被认为是宿主免疫功能紊乱和肠道菌群共同作用的结果。单层的肠上皮细胞构成了机体防御肠腔病原微生物的第一道屏障。正常情况下,肠上皮细胞对肠道共生菌是耐受的,而对肠道共生菌免疫耐受的异常激活可能参与了炎症性肠病的发病。锌指蛋白A20（zinc finger proteinA20,A20）是1990年在研究脐静脉内皮细胞肿瘤坏死因子早期应答基因时发现的,后来研究表明A20在多种细胞中均有表达,且多种刺激因素均可诱导A20表达水平的升高。另外,研究表明A20为核因子κB （nuclear factorκB, NF-κB）信号通路中关键的负性调控因子,在调控机体免疫和炎症反应中起重要作用。NF-κB信号通路过度激活在炎症性肠病发病机制中起核心作用。NF-κB是一种分布和作用均十分广泛的真核细胞转录因子,在调控机体感染、炎症、应激反应中起重要作用。一系列自身免疫病的发生与NF-κB信号通路的异常活化有关,因此正常情况下NF-κB信号通路的活化受到严密的调控。锌指蛋白A20对肿瘤坏死因子受体、Toll样受体、核苷酸结合寡聚域、T细胞或B细胞受体介导的NF-κB信号通路的活化均起着负性调控作用。另外,基因敲除实验表明A20基因是机体抵抗炎症反应不可缺少的重要功能基因。A20基因缺陷的小鼠死于多脏器严重炎症反应。特异性敲除肠上皮细胞中A20基因的小鼠对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型易感性增加,且症状更为严重,撤去DSS后结肠炎症状不能恢复。另外,在英国进行的一项全基因组学关联分析表明A20基因为克罗恩病的易感基因之一。但目前有关锌指蛋白A20在炎症性肠病发病机制中的作用尚无研究。本研究的目的旨在初步探索锌指蛋白A20在炎症性肠病发病机制中的作用。第一部分锌指蛋白A20在炎症性肠病患儿肠粘膜中的表达及意义[目的]探讨炎症性肠病患儿肠道炎症反应与锌指蛋白A20表达水平之间的关系。[方法]收集2008至2010年就诊于我院并行肠镜检查的患儿肠道黏膜标本共57份。将标本分为正常对照组（n=16）、IBD缓解期组（n=12）、IBD活动期组（n=13）和非IBD肠炎组（n=16）。内镜下取各组患儿末端回肠黏膜标本,采用荧光定量PCR和免疫组化法检测A20、NF-κB、IL-6.IL-8的表达水平。[结果]（1）NF-κB、A20在正常对照组肠黏膜中仅微量表达,IBD活动期组和非IBD肠炎组NF-κB、A20表达水平明显高于正常对照组（P均<0.01）；（2）IBD缓解期组较正常对照组NF-κB[（9.35±4.84）%vs（0.57±0.44）%,P<0.01]、IL-6（P>0.05）、IL-8（P>0.05）表达水平高,而A20在mRNA水平（P>0.05）和蛋白水平[（0.36±0.18）%vs（0.874±0.29）%,P<0.01]上表达均偏低；（3）与非IBD肠炎组相比,IBD活动期组NF-κB[（24.17±11.27）%vs（55.29±21.84）%,P<0.01、IL-6（P<0.05）、IL-8（P<0.01）表达水平明显升高,而A20在mRNA（P<0.05）和蛋白水平[（29.23±11.70）%vs（16.81±5.90）%,P<0.01]上表达均较低；（4）IBD缓解期组与非IBD肠炎组相比,IL-6、IL-8表达水平差异无统计学意义（P均>0.05）,而A20在mRNA水平（P<0.01）和蛋白水平[（29.23±11.70）%vs（0.47±0.25）%,P<0.01]上表达均较低。[结论]IBD患儿存在肠道炎症反应过度而A20表达水平上调不足的现象；A20表达水平的异常可能参与了IBD的发生和发展。第二部分锌指蛋白A20在调控肠上皮细胞炎症反应中的作用[目的]探索锌指蛋白A20在调控肠上皮细胞炎症反应中的作用。[方法]构建A20重组慢病毒载体,采用基因感染的方法分别沉默和过表达HT-29细胞中的A20基因；根据干预方式的不同,将细胞株分为三组,即HT-29细胞组,A20基因过表达组,A20基因沉默组。采用免疫荧光和western-blot的方法研究在肠上皮细胞遭受LPS刺激后增加和降低A20表达对NF-κB核转位的影响,其次采用ELISA的方法检测增加和降低A20表达对NF-κB信号通路下游促炎细胞因子TNF-a、IL-1β表达水平的影响。[结果]（1）当肠上皮细胞遭受LPS刺激后,A20表达水平上调,且随着LPS刺激量的增加,A20表达水平有增高的趋势；（2）A20基因沉默组细胞在遭受LPS刺激30分钟后,进入核内的NF-κB的量较HT-29细胞组和A20基因过表达组明显增多（P<0.05）；A20基因过表达组在遭受LPS刺激后进入核内的NF-κB的量较HT-29细胞组明显减少（P<0.05）；（3）随着LPS刺激时间的延长,肠上皮细胞中TNF-a、IL-1β表达水平呈增高趋势。（4）LPS刺激8小时内,HT-29细胞组、A20基因沉默组、A20基因过表达组TNF-a表达水平存在统计学差异（F=42.247；DF=2；P<0.001）；（5）LPS刺激8小时内不同时间点TNF-a表达水平存在统计学差异（F=31.33；DF=5；P<0.001）；且不同时间点TNF-a表达水平呈线性增高趋势（F=111.435；DF=1；P<0.001）（6）LPS刺激8小时内,HT-29细胞组、A20基因沉默组、A20基因过表达组IL-1β表达水平差异无统计学意义（F=2.456；DF=2；P=0.166）；（7）LPS刺激8小时内不同时间点HT-29细胞组、A20基因沉默组、A20基因过表达组IL-1β表达水平存在差异（F=9.216；DF=5；P<0.001）,且呈线性增高趋势（F=80.829；DF=1；P<0.001）。[结论]锌指蛋白A20对肠上皮细胞炎症反应中起着重要的负性调控作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 锌指蛋白A20在炎症性肠病患儿肠黏膜中的表达及意义
• 一、荧光定量PCR法检测A20、IL-6、IL-8在各组患儿肠粘膜中的mRNA表达水平
• 材料和方法
• 统计分析
• 结果
• 二、免疫组化法检测A20、NF-κB在各组患儿肠粘膜中的蛋白表达水平
• 材料和方法
• 统计学分析
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 锌指蛋白A20在调控肠上皮细胞炎症反应中的作用
• 一、A20重组慢病毒载体的构建、感染和稳定细胞株的筛选
• 二、沉默和过表达A20基因对NF-κB核转位的影响
• 材料和方法
• 统计分析
• 结果
• 三、沉默和过表达A20基因对NF-κB信号通路下游炎症细胞因子表达水平的影响
• 材料和方法
• 统计分析
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 文献综述
• 1. 布拉酵母对炎症性肠病的治疗作用
• 2. 细胞凋亡失调与炎症性肠病
• 第四部分 附录
• 致谢