肿瘤细胞中miR-16-1靶标的系统性鉴定及对CCNE1基因表达调控的分子机制及其功能研究

论文摘要

目前研究miRNA功能的遇到的瓶颈是需要全面性的了解microRNA对靶mRNA表达产生的效应影响以及由此导致的细胞通路和细胞表型的改变。而要认识miRNA对细胞表型的改变,就需要知道每种miRNA在体内的调控靶标有哪些。实验数据和生物信息学预测显示每个miRNA可调控数百甚至上千个靶基因。然而,现有的生物信息学方法无法准确地预测miRNA的作用靶标。因此,要深入认识miRNA的生物学功能,使用一个行之有效的实验方法来系统鉴定miRNA作用靶标是一个关键的突破口。本研究工作第一部分利用本实验室最近建立的miRACE （miRNP isolation and miPrime RACE）方法本论文系统性地鉴定了miR-16-1在特定癌细胞内的保守性和非保守性作用靶标,总共得到了330个潜在的miR-16-1的作用靶标,并对其作用靶位点和GoTerm做了初步分析,从中发现了其新的作用机制及生物学功能。细胞进入或停滞在某一个特定的细胞周期通常需要整合、加工或起始一系列信号转导通路.对于这个细胞周期过程起着至关重要功能的是周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dpendent kinase,cdk）以及它们所激活的配体—细胞周期蛋白（cyclin）.Cyclin E1（CCNE1）通过与Cdk2结合,来调节哺乳细胞从G1期到S期的细胞周期转变.在正常分裂细胞中,CCNE1的有序表达在对于DNA复制的起始、组蛋白的生物合成以及中心体循环扮演着非常重要的作用.然而在许多人类的肿瘤中,CCNE1的表达通常失调,甚至在多种肿瘤中高表达.目前对于它这种表达失调的分子机制还不是非常清楚.在本项研究工作第二部分中,本论文证实CCNE1在转录后水平上受到miR-16-1的调控,它是一种近年来备受关注的新的转录后调控元件.最初的生物信息预测分析显示,在CCNE1的3’UTR区域存在着两个进化上非常保守的miR-16-1的靶位点,在3’UTR的nt229-254 and nt459-492位置.随后我们外源转染miR-16-1进入细胞,发现miR-16-1不仅能够大幅地降低内源的CCNE1的蛋白水平,而且同时能够降低其mRNA水平.并且,外源转染的miR-16-1能够大幅度的降低含有CCNE13’ UTR序列的荧光素酶报告基因的表达,而外源导入anti-miR-16-1明显的激活了这个报告基因的活性.当把在报告基因上的预测的miR-16-1靶位点作点突变以后,这种调节就丧失了.除此之外,本论文还发现外源导入的miR-16-1能够导致细胞周期停滞在G0/G1这个细胞周期,而外源导入anti-miR-16-1能够回复这种表型.进一步的研究还发现,使用siRNA将CCNE1沉默以后,产生了与miR-16-1作用相似的细胞表型,使细胞停滞在GO/G1期,并且能够部份回复anti-miR-16-1所导致的细胞表型.概括而言,本项研究揭示了miR-16-1在肿瘤中通过靶定CCNE1基因,在调节细胞进程过程中发挥了重要的作用.这从而提供了miR-16-1在肿瘤治疗中存在着潜在的应用价值.

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1. MicroRNA简介
• 1.1 MicroRNA的概念与特征
• 1.2 miRNA的发现
• 1.3 miRNA的生物合成
• 1.4 miRNA的作用机制和生物学功能
• 1.5 miRNA与siRNA的异同
• 2. miRNA的研究方法概述
• 2.1 miRNA检测技术
• 2.1.1 Northern杂交
• 2.1.2 Real-time PCR
• 2.1.3 microarray
• 2.1.4 核酸酶保护分析技术（RPA）
• 2.1.5 原位杂交（in situ hybridistation）
• 2.2 miRNA功能分析
• 2.2.1 靶基因的计算机预测
• 2.2.2 靶基因的生物学实验寻找
• 2.2.3 上调或下调miRNA的表达
• 2.2.4 miRNA或靶基因的点突变
• 2.2.5 靶基因的实验验证
• 3. miRNA与肿瘤发生、诊断及治疗
• 3.1 miRNA与肿瘤发生
• 3.1.1 miRNA与肿瘤发生发展相关
• 3.1.2 miRNA作为原癌基因
• 3.1.3 miRNA作为抑癌基因
• 3.1.4 miRNA与致瘤病毒
• 3.2 miRNA与肿瘤诊断
• 3.3 miRNA与肿瘤治疗
• 4. microRNA在肿瘤中的细胞周期调控作用
• 4.1 MicroRNA抑制p27的表达促发肿瘤的形成
• 4.2 microRNA参与p53抑癌通路调控细胞周期
• 4.3 通过其他靶基因调控肿瘤的细胞周期进程
• 5. miR-16家族与肿瘤相关性
• 5.1 miR-16家族与白血病
• 5.2 miR-16家族与垂体瘤
• 5.3 miR-16家族与前列腺癌
• 5.4 miR-16家族与其他肿瘤
• 6. cyclin E1研究进展简介
• 6.1 细胞周期简介
• 6.2 细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶
• 6.3 细胞周期蛋白E 1（cyclin E1）的生物学特性
• 6.4 Cyclin E1与CDK2及其抑制物（cyclin-dpendent kinase inhibitors,CKIs）
• 6.5 cyclin E1与乳腺癌
• 6.6 cyclin E1与肺癌
• 7. 本课题研究内容与意义
• 7.1 第一部分 运用miRACE系统性的鉴定miR-16-1的作用靶标
• 7.2 第二部分 肿瘤细胞中miR-16-1对CCNE1表达调控的研究
• 第二章 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 实验所用菌株、细胞系及质粒
• 1.2 主要生化药品及来源
• 1.3 分子克隆所用的溶液试剂
• 1.4 细胞操作相关试剂
• 1.5 酶类
• 1.6 本研究所用引物以及RNA oligos
• 1.7 分析软件
• 1.8 绘图软件
• 1.9 仪器
• 1.10 溶液的配置
• 1.10.1 抗生素溶液
• 1.10.2 DMEM细胞培养基
• 1.10.3 细胞用PBS缓冲液
• 1.10.4 western blot所需溶液配制
• 1.10.5 免疫共沉淀所需溶液
• 2. 方法
• 2.1 普通克隆的构建方法
• 2.2 大肠杆菌化转感受态的制备与转化
• 2.2.1 受体菌的培养
• 2.2.2 化转感受态细胞的制备
• 2.2.3 化转感受态细胞的DNA转化
• 2.3 转染用超纯质粒的制备
• 2.4 细胞传代培养
• 2.4.1 细胞复苏与冻存
• 2.4.2 细胞传代
• 2.5 细胞转染
• 2.5.1 梭华-SofastTM基因转染试剂转染操作
• 2.5.2 Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤
• 2.5.3 Oligofectamine转染试剂转染步骤
• 2.6 RT-PCR
• 2.6.1 RNA的提取
• 2.6.2 基因组DNA的消解
• 2.6.3 RNA的逆转录
• 2.6.4 以合成的cDNA为模板进行PCR
• 2.7 荧光定量PCR
• 2.7.1 标准样品的制备
• 2.7.2 样品及标准样品的扩增
• 2.8 Western blot
• 2.8.1 蛋白样品的制备
• 2.8.2 蛋白含量的测定
• 2.8.3 SDS-PAGE电泳
• 2.8.4 转膜
• 2.8.5 免疫反应
• 2.8.6 化学发光,显影,定影
• 2.8.7 凝胶图像定量分析
• 2.9 UV紫外交联
• 2.10 免疫共沉淀
• 2.11 蛋白酶K降解
• 2.12 双色荧光的测定
• 2.12.1 样品及试剂的制备
• 2.12.2 荧光值的测定
• 2.13 流式细胞仪对细胞周期的检测
• 2.13.1 流式细胞术分析之前对细胞的处理
• 2.13.2 流式细胞仪分析
• 第三章 结果与讨论
• 1. 第一部分 运用miRACE系统性的鉴定miR-16-1的作用靶标
• 1.1 miRACE实验方法的建立
• 1.1.1 miRACE方法实验流程简介
• 1.1.2 miR-16-1靶标的克隆
• 1.2. miR-16-1靶标mtag的提取和初步分析
• 1.3 miR-16-1靶基因的靶位点分析
• 1.3.1 靶基因位点的分布
• 1.3.2 miR-16-1与靶基因的配对类型
• 1.3.3 miR-16-1各个靶位点的具体基因分析
• 1.4 靶基因的GoTerm分析
• 1.5. 讨论及下一步工作展望
• 2. 第二部分 肿瘤细胞中miR-16-1对CCNE1表达调控的研究
• 2.1. 实验结果
• 2.1.1 生物信息预测显示在CCNE1 3’UTR区含有miR-16-1的靶位点
• 2.1.2. miR-16-1下调内源CCNE1的表达
• 2.1.3. 荧光素酶报告基因验证miR-16-1对靶基因3’UTR区的调控
• 2.1.4. miR-16-1通过下调CCNE1的表达导致细胞周期停滞在G0/G1期
• 2.2. 讨论
• 参考文献
• 研究生期间发表的论文
• 致谢