河北杨巯基蛋白酶抑制剂基因的分离和功能鉴定

论文摘要

基因控制技术是森林有害生物综合治理（IPM）控制策略的核心技术之一，发现具有自主知识产权的功能基因是实现这一技术的关键和基础，巯基蛋白酶抑制剂（Cysteine proteinase inhibtor，CPI）是一类广泛存在于动植物和微生物体内的一个超级族，由于CPI能够有效地抑制昆虫中肠的巯基蛋白酶的水解作用而达到杀虫的目的，因此，巯基蛋白酶抑制剂已被广泛地应用于抗虫基因工程中。天牛类害虫作为我国林业上重大的森林有害生物，危害极其严重。天牛属于鞘翅目害虫，主要利用消化道内的巯基蛋白酶来进行消化，所以分离和克隆植物巯基蛋白酶抑制剂（Phytocystatins，PhyCys）基因并将其应用到天牛的抗虫基因工程中，将是一种有效的控制天牛措施。本研究选用我国抗天牛的乡土树种河北杨为研究对象，首次应用RT-PCR方法从河北杨形成层中分离和克隆了CPI基因，通过真核表达载体的构建和诱导表达，获得了经亲和层析和Western方法检测的真核表达重组蛋白，在此基础上对该基因进行了抗虫性的功能鉴定，主要研究结果如下： 1．应用RT-PCR技术从河北杨形成层中分离和克隆了CPI cDNA编码区段。序列分析表明该基因编码区长为710bp，包括一个429bp完整的开放阅读框，编码143个氨基酸残基，此序列具有典型的植物巯基蛋白酶抑制剂的保守序列。在此基础上，为获得更长的CPI cDNA，本研究应用了RT-PCR的方法获得了759bp的3’端河北杨CPI cDNA。 2．分析和预测了河北杨CPI cDNA基因所编码的蛋白质的相关特性。表明河北杨CPI是一种酸性（pI 6.51）的小分子量的多肽（15-20KDa）；亲／疏水性、蛋白质活性位点和保守区段、亚细胞定位、跨膜区域和结构功能域分析表明：该基因所编码的蛋白具有一个疏水性区域和信号肽区域（MISSSF ISPLLTLAVVLTVTI TPLISA），具有典型的cystatins保守区段和蛋白质活性位点（EQVVAGTMHHLTIE），属于一种细胞外蛋白并具有一个跨膜区域（LLTLAVVLAVTITPLISASGGFC），蛋白结构功能域分析表明，河北杨CPI也属于一种单结构域（GGVHDSQSSQ NSAEIDSLA RFAV）的小分子多肽。 3．应用PCR方法获得了795bp的河北杨CPI基因，其基因中包含一个内含子和两个外显子，具有典型的GT／AG法则。其启动子序列从上游第4个碱基-到第54个碱基，是一种来自于林木上的单结构域的植物CPI，不能归于Margis所进行的分类范畴，属于一种新的植物CPI。 4．应用CLUSTAL（1.83）软件比对了河北杨与其它43种植物CPI的氨基酸序列同源性，结果表明，河北杨和大多数植物CPI具有相同的保守区域，说明了河北杨CPI在进化上比较保守；应用MEGA3.1对上述植物CPI的系统发育分析表明，植物CPI可

论文目录

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• 正文图表目录
• 第一章 文献综述
• 1 植物CPI的发现和分布
• 2 植物CPI的结构与功能研究进展
• 2.1 植物CPI一级结构特点
• 2.1.1 植物CPI的保守序列
• 2.1.2 植物CPI的一级结构特点
• 2.1.3 植物CPI的分类
• 2.2 植物CPI二、三级结构及与功能的关系
• 2.3 植物CPI的功能
• 2.3.1 参与植物生长和发育过程中内源蛋白酶的调控
• 2.3.2 保护植物免受害虫和病原菌的侵染
• 3 植物CPI基因分离和功能的研究方法
• 3.1 植物CPI基因分离和克隆的研究方法
• 3.2 植物CPI基因功能的研究方法
• 4 植物CPI基因在植物抗病虫基因工程中的应用研究
• 4.1 植物CPI在植物抗病虫基因工程中的应用现状
• 4.2 植物CPI在林木抗病虫基因工程中的应用现状
• 4.3 植物CPI在森林生物灾害控制中的应用前景
• 4.3.1 林木蛀干害虫幼虫消化系统的生理生化研究
• 4.3.2 植物CPI的作用和调控机制,特别是CPI与害虫体内蛋白酶酶系统的互作机制需要深入研究
• 5 本论文的立项依据、研究内容、研究方法和技术路线
• 5.1 立项依据与研究意义
• 5.2 研究内容和研究方法
• 5.3 研究的技术路线
• 第二章 河北杨CPI CDNA基因的分离、克隆和氨基酸特性分析
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 试剂与仪器设备
• 1.2 研究方法
• 1.2.1 材料的采集
• 1.2.2 总RNA提取和质量检测
• 1.2.3 编码区的引物设计
• 1.2.4 3'端全长cDNA引物的设计
• 1.2.5 cDNA编码区基因的RT-PCR扩增和电泳分析
• 1.2.6 3'端全长cDNA基因的RT-PCR扩增和电泳分析
• 1.2.7 编码区段和3'端全长cDNA PCR产物的克隆和鉴定
• 1.2.8 序列鉴定
• 1.2.9 河北杨cDNA编码区和3'端全长序列分析
• 1.2.10 河北杨CPI蛋白的基本特性的预测分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA的提取和质量鉴定
• 2.2 河北杨CPI基因cDNA编码区的克隆、鉴定和序列分析
• 2.2.1 河北杨CPI基因cDNA编码区段的克隆和鉴定
• 2.2.2 河北杨CPI基因cDNA编码区的序列分析
• 2.3 河北杨与欧洲山杨CPI基因cDNA编码区段的核苷酸序列分析
• 2.4 河北杨与欧洲山杨CPI基因cDNA编码区的所推测的氨基酸序列分析
• 2.5 河北杨CPI基因cDNA 3'端序列的获得
• 2.6 河北杨CPI蛋白的特性预测
• 2.6.1 河北杨CPI蛋白的氨基酸组成分析
• 2.6.2 河北杨CPI蛋白的分子质量和等电点分析
• 2.6.3 河北杨CPI蛋白亲／疏水性分析
• 2.6.4 河北杨CPI蛋白信号肽分析
• 2.6.5 河北杨CPI蛋白功能位点的分析
• 2.6.6 河北杨CPI蛋白的亚细胞定位分析
• 2.6.7 河北杨CPI蛋白跨膜区分析
• 2.6.8 河北杨CPI蛋白的结构功能域分析
• 3 讨论
• 3.1 关于总RNA提取的问题
• 3.2 关于杨树中的植物CPI基因多样性问题
• 4 小结
• 第三章 河北杨CPI基因的分离、克隆、序列及基因结构分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株、载体、生化试剂及主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 河北杨形成层基因组DNA的提取
• 1.2.2 扩增引物设计
• 1.2.3 河北杨CPI基因的PCR扩增和电泳分析
• 1.2.4 河北杨CPI基因片断的回收、克隆、鉴定和序列分析
• 1.2.5 河北杨CPI基因的结构及启动子序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 DNA的提取
• 2.2 河北杨CPI基因的克隆、鉴定和序列分析
• 2.3 河北杨CPI基因的基因结构及相关特性的分析
• 2.3.1 河北杨CPI基因的基因结构分析
• 2.3.2 河北杨CPI基因的启动子分析
• 3.讨论
• 4 小结
• 第四章 河北杨CPI的系统发育分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 研究方法
• 2 结果与分析
• 2.1 河北杨与其它植物CPI序列的保守性分析
• 2.2 河北杨CPI的系统发育分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 河北杨CPI基因表达载体的构建和诱导表达
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 培养基、菌株和质粒载体
• 1.2.3 酶和试剂盒
• 1.2.4 仪器及其它
• 1.3 研究方法
• 1.3.1 河北杨CPI真核表达载体的构建
• 1.3.2 河北杨CPI基因的诱导表达、重组蛋白的纯化和检测
• 2 结果与分析
• 2.1 河北杨CPI真核表达载体的构建
• 2.1.1 河北杨CPI真核表达目的片段的获得
• 2.1.2 真核表达载体的构建
• 2.2 重组蛋白的诱导表达和纯化
• 2.3 重组蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.4 重组蛋白的Western检测
• 3 讨论
• 3.1 关于原核表达载体和真核表达载体的构建和诱导表达的问题
• 3.2 关于Western的检测问题
• 4.小结
• 第六章 河北杨CPI基因的功能鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组蛋白的处理
• 1.2.2 重组蛋白的含量的测定
• 1.2.3 河北杨CPI重组蛋白对松墨天牛生长发育的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 重组蛋白含量的测定
• 2.2 重组蛋白对松墨天牛生长发育的影响
• 2.2.1 不同含量的重组蛋白与松墨天牛死亡时间和死亡率的关系。
• 2.2.2 不同含量的重组蛋白对存活松墨天牛体重的影响
• 2.2.3 不同含量的重组蛋白对松墨天牛活动能力的影响和幼虫死亡特征的观察
• 3 讨论
• 3.1 关于植物CPI功能鉴定的方法学评价
• 3.2 河北杨CPI的抗虫效果的评价
• 4 小结
• 第七章 结论
• 后记
• 参考文献
• 致谢
• 附录