短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

论文摘要

谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase, GAD）是一类磷酸吡哆醛依赖性酶,广泛存在于动物、植物和微生物中,不仅能催化谷氨酸脱羧产生γ-氨基丁酸,而且还可作为诊断型酶制剂用于Ⅰ型糖尿病的诊断。γ-氨基丁酸（y-Aminobutyric acid或y-Aminobutanoic acid,简称GABA）,又称4-氨基丁酸、氨酪酸,是一种非蛋白氨基酸,广泛分布于动植物体内,为中枢神经系统中的一种重要的神经递质,具有重要的生理功能。本课题组经选育得到了一株γ-氨基丁酸高产菌株,从形态学上初步判定为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）,其γ-氨基丁酸的最大产量已达到76.4 g/L。本文对该菌的谷氨酸脱羧酶基因进行了克隆和表达,以用于GABA的制备和GAD酶学性质的研究及应用。论文对上述γ-氨基丁酸高产菌株的16s rDNA序列进行扩增和测序,对该菌进行菌种鉴定,在此基础上利用GenBank对已有全长序列的亲缘相近的乳酸菌的GAD基因进行了收集和分析,根据分析结果,设计了一系列简并引物。在提取该γ-氨基丁酸高产菌株的基因组后,分别采用不同的上下游引物在不同PCR条件下进行了GAD基因的扩增,最终得到了长度约为1407bp、1440bp和1881bp的三个核酸片断,经分析发现三个片断大小分别与已有乳酸菌GAD基因相当。分别连接T-A克隆载体后测序,分析测序结果发现,三个片断均分别与已报道的谷氨酸脱羧酶基因高度近似且具有GAD的保守序列,证明所得PCR产物均为GAD编码基因。以pET-28a（+）为载体,使用限制性内切酶分别将三个GAD基因片段从T-A克隆载体上酶切并切胶回收,经过优化酶切、回收纯化和连接条件,构建表达质粒。将连接反应产物转化E.coli BL21（DE3）,经筛选,得到表达GAD的工程菌E.coli BL21（DE3）-pET-28a（+）-GAD1407, E.coli BL21（DE3）-pET-28a（+）-GAD1440,和E.coli BL21（DE3）-pET-28a（+）-GAD 1881。通过对诱导表达条件的调整,实现了GAD1407和GAD1440的胞内可溶表达,并测定了GAD1407的谷氨酸脱羧活性。研究了影响重组工程菌E.coli BL21（DE3）-pET28a（+）-GAD1407生长的培养基组成,采用合成培养基二次发酵诱导的方法提高了重组蛋白的胞内可溶表达量,并考察了影响重组酶表达水平的诱导条件（诱导剂浓度、诱导时机、诱导后培养时间）等。采用Ni-NTA亲和纯化方法对所得重组GAD1407进行了纯化,获得了纯酶。考察了重组谷氨酸脱羧酶的基本酶学性质,其最适反应温度为48℃,最适反应pH值为4.8。此外还测定了该酶热稳定性和PLP依赖性,测定了动力学参数,为该酶的工业化应用创造了条件。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 γ-氨基丁酸
• 1.2.1 γ-氨基丁酸（GABA）的结构与性质
• 1.2.2 GABA的生理功能
• 1.2.3 GABA的应用
• 1.2.4 GABA的制备
• 1.3 谷氨酸脱羧酶
• 1.3.1 谷氨酸脱羧酶研究进展
• 1.3.2 谷氨酸脱羧酶性质
• 1.3.3 谷氨酸脱羧酶的克隆和表达
• 1.4 PCR
• 1.4.1 PCR原理简介
• 1.4.2 PCR引物设计原则
• 1.5 大肠杆菌和pET表达系统
• 1.5.1 质粒表达载体
• 1.5.2 表达宿主菌
• 1.6 论文思路及主要内容
• 第二章 短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 菌种与质粒
• 2.2.2 工具酶与试剂盒
• 2.2.3 化学试剂
• 2.2.4 培养基及抗生素
• 2.2.5 主要实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞生长测定
• 2.3.2 短乳杆菌基因组抽提
• 2.3.3 PCR扩增及PCR产物纯化回收
• 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.5 感受态细胞制备及质粒转化
• 2.3.6 质粒抽提
• 2.3.7 T-A克隆
• 2.3.8 转化子的菌落PCR鉴定
• 2.3.9 测序及引物合成
• 2.3.10 菌种保藏
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 短乳杆菌培养
• 2.4.2 γ-氨基丁酸高产菌株的菌种鉴定
• 2.4.3 克隆引物设计
• 2.4.4 PCR扩增目的片段
• 2.4.5 GAD基历T-A克隆
• 2.4.6 GAD基因测序
• 2.5 本章小结
• 第三章 重组谷氨酸脱羧酶的表达及表达条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 菌种与质粒
• 3.2.2 工具酶与试剂盒
• 3.2.3 化学试剂
• 3.2.4 培养基及抗生素
• 3.2.5 主要实验仪器
• 3.3 分析检测方法
• 3.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.3.2 考马斯亮蓝法
• 3.3.3 活性测定方法
• 3.3.4 纸层析
• 3.3.5 高效液相色谱法
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因亚克隆
• 3.4.2 谷氨酸脱羧酶的重组表达
• 3.4.3 培养条件优化
• 3.4.4 表达条件优化
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因亚克隆
• 3.5.2 重组谷氨酸脱羧酶的表达
• 3.5.3 培养条件的优化
• 3.5.4 细胞破碎方式影响
• 3.5.5 诱导条件优化
• 3.6 本章小结
• 第四章 重组谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 菌种与质粒
• 4.2.2 实验材料
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 粗酶液的制备
• 4.3.2 Ni-NTA纯化
• 4.3.3 分析检测方法
• 4.3.4 催化性质考察
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 Ni-NTA纯化
• 4.4.2 温度对重组GAD活性的影响
• 4.4.3 pH值对重组GAD活性的影响
• 4.4.4 PLP对重组GAD的影响
• 4.4.5 重组GAD动力学分析
• 4.5 本章小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献