黄芩与党参多糖的提取及其体外抗NDV活性研究

论文摘要

新城疫是由NDV引起的一种急性、败血性、高度传染性疾病,死亡率极高,对我国养禽业危害性极大。防治NDV的措施主要靠疫苗接种,特别是弱毒疫苗的应用,目前缺乏有效的治疗药物。抗病毒西药长期应用易产生耐药性,降低疗效,病情复发,成为临床治疗及新药开发的重要问题,而中药在防治病毒感染性疾病方面更具有独特的优势和广阔的发展前景。本试验在前期初步筛选的具有抗新城疫病毒活性中药基础上,以黄芩多糖（Scutellaria baicalensis Georgi polysaccharide ,SBGP）和党参多糖（Codonpsis Pilosula polysaccharide,CPP）为研究对象,开展了如下研究内容:本课题采用水提醇沉法提取黄芩及党参粗多糖,在单因素考察基础上通过正交实验确定两种多糖提取的最佳条件。黄芩多糖优化的提取条件为:即料液比为1:20,提取时间为60min,溶剂浓度为85%,提取温度为60℃,该条件下黄芩多糖提取率最好,为19.77%,通过苯酚-硫酸法测定多糖含量为0.71%。党参多糖优化的提取条件为:即料液比为1:20,提取时间为100min,溶剂浓度为85%,提取温度为40℃,该条件下党参多糖的提取率最高,为29.03%,并通过苯酚-硫酸法测定多糖含量为2.87%。通过Sevag法除去蛋白、真空干燥法将提取物烘干、透析法除去小分子物质及无机物等手段纯化多糖提取物以后,采用体外细胞培养法评价了两种多糖提取物抗新城疫病毒活性。结果显示:先加多糖后加病毒时黄芩多糖及党参多糖浓度为125μg·mL-1和62.5μg·mL-1时,具有显著的抗病毒活性,多糖浓度为31.25μg·mL-1及15.63μg·mL-1时,可以判定其具有一定的抗病毒活性,多糖浓度为7.81μg·mL-1时,可以判定为无抗病毒活性,黄芩多糖及党参多糖的治疗指数（TI）均为8;先加病毒后加多糖时黄芩多糖及党参多糖浓度为125μg·mL-1和62.5μg·mL-1时,具有显著的抗病毒活性,黄芩多糖浓度为31.25μg·mL-1及15.63μg·mL-1时,可以判定其具有一定的抗病毒活性,黄芩多糖浓度为7.81μg·mL-1时,可以判定为无抗病毒活性,黄芩多糖TI为8。但是,党参多糖在31.25μg·mL-1可以判定其具有一定的抗病毒活性,在15.63μg·mL-1和7.81μg·mL-1时无抗病毒活性,党参多糖的TI为4;病毒及多糖同时加入时黄芩多糖浓度为125μg·mL-1和62.5μg·mL-1时具有一定的抗病毒活性,其他浓度时则无抗病毒活性,黄芩多糖的TI为2,这表明黄芩多糖直接杀灭NDV的作用较弱;党参多糖各浓度均无抗病毒活性。通过以上研究,优化了黄芩多糖及党参多糖的提取条件,确定了两种多糖在细胞水平上具有一定的抗新城疫病毒的作用,尤其是在先加病毒和先加多糖两种方式中具有明显的抗病毒作用,通过鸡胚试验进一步证明了黄芩及党参多糖都具有一定的抗NDV的作用。黄芩多糖及党参多糖体内抗新城疫病毒作用有待于进一步研究,本课题的研究结果为临床防治新城疫有效药物的研制提供参考依据。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 新城疫的研究
• 1.1.1 NDV 的传播
• 1.1.2 我国 NDV 防治现状
• 1.2 中药抗病毒的研究现状
• 1.2.1 中药抗病毒的有效成分
• 1.2.2 中药抗病毒的作用机制
• 1.3 多糖的研究现状
• 1.3.1 中药有效成分的提取研究进展
• 1.3.2 多糖的含量分析
• 1.3.3 多糖的结构分析
• 1.3.4 多糖的干燥
• 1.3.5 多糖的除色素
• 1.3.6 多糖的除蛋白
• 1.3.7 多糖的生物活性
• 1.4 黄芩的研究现状
• 1.4.1 黄芩主要化学成分
• 1.4.2 黄芩的药理作用
• 1.4.3 黄芩的抗病毒作用
• 1.5 党参的研究现状
• 1.5.1 党参的主要成分
• 1.5.2 党参的药理作用
• 1.5.3 党参多糖的药理作用
• 1.6 本实验的研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 溶液的配置
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 黄芩多糖及党参多糖的提取
• 2.2.2 多糖的含量测定
• 2.2.3 多糖的纯化
• 2.2.4 多糖的分析与鉴定
• 2.2.5 黄芩及党参多糖对细胞最大安全浓度的确定
• 2.2.6 病毒的增殖及测定
• 2.2.7 黄芩及党参多糖体外抗 NDV 的测定
• 2.2.8 多糖鸡胚内抗 NDV 测定
• 2.2.9 数据处理
• 3 结果及分析
• 3.1 硫酸-苯酚法测得葡萄糖的标准曲线
• 3.2 单因素对黄芩多糖提取的影响结果
• 3.2.1 提取时间对提取效率的影响
• 3.2.2 提取温度对提取效率的影响
• 3.2.3 提取料液比对提取效率的影响
• 3.2.4 提取溶剂浓度对提取效率的影响
• 3.2.5 正交试验结果
• 3.3 单因素对党参多糖提取率及含量的影响
• 3.3.1 提取时间对提取效率的影响
• 3.3.2 提取温度对提取效率的影响
• 3.3.3 提取料液比对提取效率素的影响
• 3.3.4 提取溶剂浓度对提取效率的影响
• 3.3.5 正交试验结果
• 3.4 多糖的分析与鉴定
• 3.4.1 黄芩多糖的分析与鉴定
• 3.4.2 党参多糖的分析与鉴定
• 3.5 细胞安全浓度的测定
• 3.5.1 黄芩多糖对细胞的最大安全浓度
• 3.5.2 党参多糖对细胞的最大安全浓度
• 3.6 病毒毒力的测定
• 3.7 黄芩多糖及党参多糖抗 NDV 活性
• 3.7.1 40 倍镜下观察的细胞正常形态及病变形态
• 3.7.2 黄芩及党参多糖抗 NDV 的测定
• 3.7.3 鸡胚法测定的多糖的抗病毒活性
• 4 讨论
• 4.1 黄芩及党参多糖的提取及纯化
• 4.1.1 多糖的提取
• 4.1.2 多糖含量的测定
• 4.1.3 除多糖色素
• 4.1.4 除多糖中的蛋白
• 4.2 黄芩多糖及党参多糖对细胞安全浓度的测定
• 4.2.1 鸡胚成纤维细胞培养
• 4.2.2 细胞安全浓度的测定
• 4.3 NDV 的增殖与毒力测定
• 4.4 黄芩多糖及党参多糖抗 NDV 的研究
• 4.4.1 研究方法的选择
• 4.4.2 抗病毒实验设计体系的差异
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文