活细胞染料CFSE在人γδT细胞增殖及分泌细胞因子研究中的应用

论文摘要

目的:1.建立活细胞染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFDA-SE,也简称为CFSE）染色流式细胞术检测淋巴细胞增殖的方法。2.应用活细胞荧光染料CFSE染色和流式细胞术检测方法观察不同激活剂包括结核杆菌抗原（Mtb-Ag）激活人外周血T细胞后各亚群的增殖反应动力学。3.观察Mtb-Ag激活人外周血中γδT细胞产生白介素2（IL-2）和γ-干扰素（IFN-γ）与细胞增殖动力学的相互关系。 方法:1.常规分离PBMC,经CFSE染色后,制成浓度为1～2×106/ml细胞悬液。分以结核杆菌抗原（Mtb-Ag）,植物血凝素（PHA）,抗CD3单抗（CD3mAb）刺激,加IL-2扩增5-12d,用PE标记T细胞亚群表面分子单抗染色,最后用流式细胞仪检测活化后T细胞各亚群的表型及其所占比例,并用ModFit软件分析T细胞各亚群的增殖动力模型。2.用CFSE对Mtb-Ag活化培养4d后的外周血淋巴细胞染色,5%CO2,37℃培养72小时后,上流式细胞仪检测γδT细胞增殖情况,同时用佛波醇脂（PMA）和离子霉素（Ionomycin）继续刺激活化,Monesin阻断细胞内因子向细胞外的分泌,检测细胞因子IL-2及IFN-γ的分泌情况。 结果:1.PHA和CD3mAb主要活化总T细胞,活化5天后,CD3+T细胞在PBMC中占到90%以上,CD4+T细胞和CD8+T细胞出现明显的分化,CD8+T细胞的增殖优先于CD4+T细胞。用ModFit软件分析,CD4+T细胞前四代比例大于CD8+T细胞,第五第六代的比例则明显低于CD8+T细胞。2.Mtb-Ag主要刺激γδT细胞的增殖,活化12天时,γδT细胞在PBMC的比例占到57.80%,活化14天时,γδT细胞在PBMC的比例高达80%以上,ModFit软件分析,CD4+T细胞分裂集中在前四代,γδT细胞则主要集中在第六到第八代。3.PBMC经结核杆菌活化,再经佛波醇脂（PMA）和离子霉素（ionomycin）刺激,γδT细胞分泌IFN-γ的能力强于分泌IL-2

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 细胞来源
• 2.2 主要试剂（试剂浓度和配制方法）
• 2.3 主要仪器和设备
• 2.4 外周血单个核细胞（PBMC）的分离
• 2.5 CFSE标记外周血单个核细胞（PBMC）
• 2.6 外周血单个核细胞（PBMC）活化培养
• 2.7 流式细胞术检测和分析T淋巴细胞亚群增殖及细胞因子的方法
• 2.8 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 不同浓度CFSE染色后T细胞各亚群的荧光强度
• 3.2 PHA，CD3mAb刺激PBMC后T细胞各亚群比例
• 3.3 Mtb-Ag刺激PBMC后γδT细胞的扩增
• 3.4 PHA，CD3mhb，Mtb-Ag激活T细胞后各T细胞亚群的增殖动力学
• 3.5 Mtb-Ag活化后的PBMC经PMA+Ionomycin刺激IL-2和IFNγ分泌情况
• 4 讨论
• 4.1 以CFDA-SE标记方法研究淋巴细胞增殖的探讨
• 4.2 Mtb-Ag特异性活化γδT细胞
• 4.3 γδT细胞内IL-2和IFN-γ的检测
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 附录
• 8 致谢
• 9 综述 NF-κB在免疫调节中的作用
• 参考文献