论文摘要
研究目的免疫因素在肾小管性酸中毒发病中的作用日渐受到关注。已有研究报道肾小管性酸中毒患者血清中存在抗肾小管上皮细胞自身抗体,但这些抗体的具体种类尚未明确。本实验旨在检测肾小管性酸中毒患者血清中是否存在抗v型氢离子腺苷三磷酸酶（v-H+-ATP酶）B1亚基及B2亚基自身抗体。研究方法研究对象:肾小管性酸中毒患者11例,其中10例合并干燥综合征:单纯干燥综合征患者8例;健康对照8例。所有患者均为未治疗的新发或复发病例。取各研究对象全血利用流式细胞技术进行免疫学检查,部分血清进行生化等指标检测,部分血清用于间接免疫荧光检测自身抗体。先确定患者血清中是否存在抗肾小管上皮细胞抗体,以及观察v-H+-ATP酶B1亚基和B2亚基在正常人肾脏组织的表达特点。在正常人肾脏组织石蜡切片上,加肾小管性酸中毒患者血清原液、单纯干燥综合征患者血清原液、健康对照血清原液、抗v-H+-ATP酶B1亚基抗体或抗v-H+-ATP酶B2亚基抗体作为一抗孵育4℃过夜,以异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocynate,FITC,绿色荧光）-山羊抗人免疫球蛋白（Immunoglobulin,IgG）孵育,标记血清中的抗肾小管上皮细胞自身抗体,或四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC,红色荧光）-兔抗山羊IgG孵育,标记v-H+-ATP酶B1亚基或B2亚基,4,6-联脒-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenyl-indolediacetare,DAPI,蓝色荧光）标记细胞核并封片。结果阳性者,进一步稀释相应的一抗,重复上述实验,直至结果为阴性。并为以下间接免疫荧光双标记实验选取适当的稀释比例。为检测肾小管性酸中毒患者血清中是否存在抗v-H+-ATP酶B1亚基及B2亚基自身抗体,先用肾小管性酸中毒患者血清原液、单纯干燥综合征患者血清原液或健康对照血清原液与正常人肾脏组织石蜡切片孵育4℃过夜,然后加不同稀释度的山羊抗人v-H+-ATP酶B1亚基抗体孵育4℃过夜,再先后加TRITC-兔抗山羊IgG及FITC-山羊抗人IgG荧光二抗避光孵育,DAPI标记细胞核并封片。结果阳性者,将血清按不同比例稀释,重复上述实验,直至结果阴性。血清中抗v-H+-ATP酶B2亚基自身抗体的检测同抗v-H+-ATP酶B1亚基自身抗体的检测。每次实验均设阴性对照。结果一般临床指标检查结果:与单纯干燥综合征患者和健康对照相比较,肾小管性酸中毒患者的血清氯水平明显升高,血清二氧化碳明显下降,尿pH明显升高,流式细胞学检查、免疫球蛋白及补体检查结果均提示免疫学变化。血清抗肾小管上皮细胞自身抗体检测结果:11例肾小管性酸中毒患者中,有6例患者肾小管上皮细胞内呈明亮的绿色荧光,提示抗肾小管上皮细胞抗体阳性;当把自身抗体阳性的血清逐渐稀释时,其绿色荧光的强度呈不同程度地逐渐减弱,提示随着血清的稀释,自身抗体的浓度逐渐下降;而8例单纯干燥综合征患者及8例健康对照的肾小管上皮细胞内无明显绿色荧光,提示其血清中抗肾小管上皮细胞自身抗体阴性。v-H+-ATP酶B1亚基及B2亚基在正常肾脏组织的表达结果:标记v-H+-ATP酶B1亚基的红色荧光在肾脏中呈闰细胞特异性散在分布,标记v-H+-ATP酶B2亚基的红色荧光在肾小管上皮细胞内沿管腔面呈连续的线状分布。抗v-H+-ATP酶B1亚基及B2亚基自身抗体检测结果:11例肾小管性酸中毒患者中,有6例患者标记v-H+-ATP酶B1亚基的红色荧光强度明显减弱,提示其血清对于抗v-H+-ATP酶B1亚基抗体有明显的阻断作用;当把自身抗体阳性患者的血清逐渐稀释,标记v-H+-ATP酶B1亚基的红色荧光强度逐渐增强,提示随着血清的稀释,其对于抗v-H+-ATP酶B1亚基抗体的阻断作用呈不同程度的减弱,提示不同稀释度血清的抗体效价强度不同;而8例单纯干燥综合征患者和8例健康对照血清则无上述阻断作用。抗v-H+-ATP酶B2亚基自身抗体的检测结果同抗v-H+-ATP酶B1亚基自身抗体检测结果。以上结果提示肾小管性酸中毒血清中存在抗v-H+-ATP酶B1亚基及B2亚基自身抗体。结论肾小管酸中毒患者血清中存在抗肾小管上皮细胞自身抗体,阳性率为6/11;肾小管性酸中毒患者血清中存在抗v-H+-ATP酶B1亚基及B2亚基自身抗体,阳性率均为6/11:肾小管性酸中毒患者血清中的抗v-H+-ATP酶B1亚基及B2亚基自身抗体是抗肾小管上皮细胞自身抗体中的两种。
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