论文摘要
目的:Lewis寡糖抗原是细胞表面糖复合物（糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖）中的糖链成分,已经发现其在多种肿瘤中的合成异常增加,与肿瘤增殖、浸润、转移、临床分期及预后密切相关。大量的研究发现,Lewis X（LeX）/Lewis Y（LeY）抗原在膀胱癌、胃癌、大肠癌、皮肤癌等癌细胞中均有较高表达,LeX/LeY的表达水平也因此作为评价恶性肿瘤性疾病恶性程度的重要指标,并对肿瘤的诊断、治疗以及预后判定提供帮助。研究表明,通过抗体封闭LeY,可以降低肿瘤细胞恶性程度,影响其恶性生物学行为。然而,是否能够通过RNAi技术干涉肿瘤细胞特异的岩藻糖基转移酶的合成和表达,降低肿瘤LeX/LeY寡糖抗原的合成,在基因水平抑制肿瘤的增殖、浸润和转移,目前国内外尚未见报道。本实验将有利于探讨肿瘤的糖分子病理学机制,为肿瘤的靶向基因治疗提供新的思路和手段。方法:1、应用FUT1和FUT4的各2个SiRNA干扰质粒,采用脂质体介导的方法对人子宫颈上皮癌细胞A431进行瞬时转染。2、流式细胞术检测LeX和LeY表达率。3、克隆形成实验评估细胞增殖能力。4、流式细胞术检测细胞周期分布。5、应用AnnexinⅤ/PI双标记的方法,检测A431细胞凋亡。6、流式细胞术检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达。结果:1、FUT1和FUT4的RNA干涉抑制A431细胞表面LeX/LeY表达。流式细胞仪检测转染后细胞表面LeX合成水平,表达率为FUT1-1（51.29±0.98）%、FUT1-2（47.30±0.93）%、FUT4-1（44.59±1.99）%、FUT4-2（43.82±0.48）%,明显低于对照组（92.09±2.49）%和空载体组（84.57±1.38）%（p<0.01）;LeY的表达率为FUT1-1（28.34±1.01）%、FUT1-2（29.33±0.99）%、FUT4-1（35.11±1.57）%、FUT4-2（41.50±1.03）%,明显低于对照组（81.36±1.07）%和空载体组（74.84±0.84）%（p<0.01）。2、FUT1和FUT4的RNA干涉使细胞生长受明显抑制。克隆形成实验显示,转染组克隆形成率为FUT1-1（11.73±0.62）%、FUT1-2（13.33±0.61）%、FUT4-1（8.53±0.61）%、FUT4-2（6.80±0.80）%,明显低于对照组（22.80±0.80）%和空载体组（18.93±1.29）%（p<0.01）。3、FUT1和FUT4的RNA干涉使细胞周期阻滞于S期。细胞周期分析显示,转染组细胞周期中G0/G1期比例为FUT1-1（40.83±0.03）%、FUT1-2（37.20±0.63）%、FUT4-1（40.68±0.04）%、FUT4-2（42.79±0.45）%,明显低于对照组（50.69±0.39）%（p<0.01）,但与空载体组（42.82±1.62）%比较无明显差异;S期比例为FUT1-1（57.49±0.09）%、FUT1-2（61.89±0.50）%、FUT4-1（58.38±0.17）%、FUT4-2（55.73±0.60）%,明显高于对照组（34.11±0.61）%和空载体组（41.85±0.24）%（p<0.01）;G2/M期比例为FUT1-1（1.67±0.11）%、FUT1-2（0.91±0.25）%、FUT4-1（0.94±0.19）%、FUT4-2（1.49±0.49）%,明显低于对照组（15.20±0.29）%和空载体组（16.26±0.99）%（p<0.01）。4、FUT1和FUT4的RNA干涉诱导A431细胞发生凋亡。经流式细胞术检测,转染组细胞凋亡率为FUT1-1（43.82±0.47）%、FUT1-2（ 30.11±0.56） %、FUT4-1（49.35±0.47）%、FUT4-2（60.76±0.57）%,明显高于对照组（4.99±0.07）%和空载体组（7.99±3.76）%（p<0.01）。5、FUT1和FUT4的RNA干涉使Bcl-2表达下调及Bax表达上调。流式细胞术分析表明,转染组Bcl-2的表达率为FUT1-1（1.98±0.26）%、FUT1-2（3.16±0.29）%、FUT4-1（1.98±0.14）%、FUT4-2（1.46±0.07）%,明显低于对照组（11.64±1.01）%和空载体组（7.44±1.23）% （p <0.01）;Bax的表达率为FUT1-1（20.36±0.88）%、FUT1-2（13.60±2.25）%、FUT4-1（21.43±0.97）%、FUT4-2（18.47±0.79）%,明显低于对照组（5.93±0.25）%和空载体组（7.41±1.23）%（p<0.01）。结论:FUT1和FUT4的RNA干涉能够降低A431细胞表面寡糖抗原LeX/LeY合成;影响A431细胞的增殖,使细胞周期阻滞于S期;诱导A431细胞发生凋亡。并使凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调以及Bax表达上调。