论文摘要
骨代谢的稳态由成骨细胞和破骨细胞共同维持的,其中,破骨细胞是骨转换的启动者。大多数骨质疏松的发生与破骨细胞的过渡分化和活性增强相关。破骨细胞调控机制非常复杂,多条信号通路涉及的多种受体、接头蛋白、转录因子等均已被证明可以直接或间接地调控破骨细胞的分化。NRAGE （neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog）即黑色素瘤相关抗原,作为细胞内接头蛋白,已被证明可通过不同的信号通路影响细胞的存活、增殖、凋亡和分化等多种活动。我们前期实验表明,NRAGE基因敲除可明显促进破骨细胞的分化,但其机制尚不清楚。鉴于此,本论文从直接作用（RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化）和间接作用（即成骨细胞对破骨细胞的影响）两方面探讨了NRAGE影响破骨细胞分化的可能调控机制。第一部分：NRAGE对破骨细胞的直接调控作用及机制研究（1）前期实验表明,NRAGE基因敲除能够明显促进RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化。本论文扩大样本量（n=6）,通过TRAP染色确证了NRAGE对破骨细胞分化的直接调控作用,Q-PCR扩增破骨细胞分化过程中NRAGE的表达也进一步明确了NRAGE对破骨细胞分化的负调控作用。（2）利用Q-PCR,我们分析了在破骨细胞分化过程中,两个关键的转录因子c-fos和NFATc1的表达,结果发现,NRAGE敲除后能够明显提高c-fos和NFATc1的表达,而且RANKL处理后,NRAGE敲除组提高更为明显。（3）MAPK（ERK1/2,p38和JNK）是促进破骨细胞分化的经典信号通路,其中p38和JNK信号通路的激活可上调破骨细胞中c-fos和NFATc1的表达。同时,在细胞凋亡的研究中,NRAGE被证明参与ERK1/2, p38和JNK信号通路的调节。鉴于此,我们分离了敲除组和野生组骨髓单核细胞,用RANKL和M-CSF处理不同的时间段（0,5,15和30分钟）,收集蛋白,Western blot分析ERK1/2,p38和JNK的磷酸化水平,结果发现：NRAGE敲除组ERK1/2, p38和JNK的磷酸化水平并没有明显提高,提示NRAGE敲除对破骨细胞分化的直接促进作用并不是通过MAPK（ERK1/2, p38和JNK）通路而实验的。NRAGE敲除后对c-fos和NFATc1的表达的上调和破骨细胞的分化促进作用可能是通过NF-κB（前期已经证明,见许丽娟论文）,亦或其他尚未检测的信号通路来实现。第二部分：NRAGE对破骨细胞的间接调控作用及机制研究前期实验表明,NRAGE可促进成骨细胞的分化和活性,活性提高的成骨细胞进而促进破骨细胞分化,但是机制并不清楚。为此,本论文分离纯化了敲除组和对照组新生鼠颅骨细胞,并进行了成骨分化诱导（抗坏血酸,终浓度50μg/mL+β-甘油磷酸钠,终浓度10mM）,将诱导分化7天的成骨细胞和未诱导分化的成骨细胞进行了基因表达谱分析,经Q-PCR验证表明,该基因芯片可靠性较好。利用FatiGO数据库对差异表达基因的分子功能和生物功能分析,并结合文献查阅,发现NRAGE基因敲除组与野生组比较,在可能与骨发育或骨代谢相关的基因中,2倍上调基因43个,2倍下调基因41个。采用Biocarta数据库,对差异表达基因信号通路分析表明,差异表达基因主要集中在炎症、细胞因子和趋化因子以及Wnt等信号通路上。根据基因芯片的提示,我们从Wnt信号通路、炎性因子,以及经典的RANKL/OPG的比率等方面,分析了NRAGE敲除后成骨细胞对破骨细胞分化影响的可能机制。结果发现：（1）Wnt5a刺激后,NRAGE敲除组和野生组破骨细胞分化并没有明显改变,提示Wnt5a介导的信号通路没有参与NRAGE敲除后的破骨分化增强过程。（2）Q-PCR扩增不同分化阶段的成骨细胞（敲除组和野生组）中炎性因子（Ccl2、Cox-2、 Cxcl1、Cxcl5、IL-6、KC）的表达,结果发现大部分炎症因子在敲除组中的表达都高于野生组,尤其在成骨分化前期（day0和day7）,炎性因子提高程度更为明显,提示：NRAGE敲除后可能增强了成骨细胞炎性因子的合成,从而进一步促进了破骨细胞的分化。（3） RANKL/OPG比率是判断成骨细胞对破骨细胞分化影响的一个重要指标。Q-PCR和Western blot结果显示,NRAGE敲除后,OPG在成骨分化整个过程中表达明显下调,而RANKL在成骨分化早期（day0）和后期（day28）表达上调,在day7和dayl4表达没有明显改变。其RANKL/OPG比率在NRAGE基因敲除小鼠成骨细胞整个分化过程中明显上调,这可能是NRAGE基因敲除小鼠成骨细胞促进破骨细胞分化的一个重要机制之一。主要结论：1. NRAGE基因敲除可直接促进破骨细胞分化,影响破骨细胞分化的关键转录因子c-fos和NFAT1明显上调,但破骨细胞的分化增强和c-fos、NFATcl的上调作用并不是通过MAPK（ERKl/2, p38和JNK）来实现。2. NRAGE敲除后,其成骨细胞可间接促进破骨细胞分化,成骨细胞炎性因子合成的增强和RANKL/OPG比率的提高可能成骨细胞对破骨细胞影响的重要机制。