二氯喹啉酸降解菌的分离及降解特性研究

论文摘要

二氯喹啉酸（Quinclorac）属喹啉羧酸类除草剂。在田间残效期长,危害后茬作物。本文作者从农药厂长期受除草剂污染土壤中分离筛选到一株可以利用二氯喹啉酸为唯一碳,氮源生长的菌株。取代号为F1。首先,对F1菌株进行16S rDNA测序比对,序列分析显示F1菌株与Pseudomonas aeruginosa的16SrDNA序列具有100%相似性。结合F1菌株的主要生理生化特征,杆菌、革兰氏阴性、葡萄糖氧化产酸、氧化酶试验阳性、接触酶试验阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性。淀粉水解、MR试验、VP试验和吲哚试验均为阴性。将F1鉴定为Pseudomonas sp.其次,研究了菌株F1对二氯喹啉酸的降解特性。结果表明: F1菌株以二氯喹啉酸为唯一碳源和氮源生长时,降解二氯喹啉酸的最适温度为35℃。pH值为6-8时,36h内对500mg/L二氯喹啉酸降解率达到90%左右。实验表明外加碳源葡萄糖并不能提高菌株F1降解二氯喹啉酸的能力。F1菌株在土壤二氯喹啉酸降解实验中也有显著的降解效果,并且施加菌剂的量越多降解效果越明显,但是当菌剂的施加量达到5×109个/kg时进一步提高施加量对降解二氯喹啉酸速率影响不显著。数据显示,随着时间的增加二氯喹啉酸的降解速率逐渐放慢,这可能是菌株的种群优势在自然环境中逐渐退化的原因。最后,通过SDS-PAGE检测了在二氯喹啉酸胁迫下,F1菌株的蛋白表达差异,通过检测杂环芳烃的主要降解酶类邻苯二酚双加氧酶酶活在不同培养条件下的变化情况,确定了邻苯二酚双加氧酶在降解二氯喹啉酸的过程中具有十分重要的作用。将不同培养条件下的F1菌株的RNA反转录为cDNA,进行该酶的RT-PCR扩增,扩增结果从RNA表达水平上证明了F1菌株的邻苯二酚双加氧酶由二氯喹啉酸诱导产生,并在二氯喹啉酸的降解过程中发挥着重要作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1 我国农药工业现状及未来发展趋势
• 2 有机氯农药
• 2.1 有机氯农药的使用状况与危害
• 3 除草剂
• 3.1 除草剂的发展概况
• 4 二氯喹啉酸
• 4.1 二氯喹啉酸简介
• 4.2 二氯喹啉酸对土壤微生物和农作物的影响
• 4.2.1 对土壤微生态的影响
• 4.2.2 对农作物的影响
• 4.3 二氯喹啉酸自然条件下的降解
• 4.4 二氯喹啉酸残留测定方法的研究
• 5 农药的微生物降解及污染土壤的修复
• 5.1 农药降解微生物
• 5.2 参与杂环芳香族化合物降解的微生物
• 5.3 细菌修复农药污染土壤的机理
• 5.3.1 酶促反应
• 5.3.2 矿化作用
• 5.3.3 共代谢作用
• 5.3.4 生化作用
• 6 本研究的目的与意义
• 第二章 二氯喹啉酸降解菌的分离与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 药品
• 1.2 土样
• 1.3 仪器
• 1.4 培养基
• 1.5 二氯喹啉酸降解菌的富集培养和驯化
• 1.6 菌株分离
• 1.7 分离菌株的形态观察
• 1.8 分离菌株的生理生化试验
• 1.9 分离菌株的16S rDNA 的PCR 扩增、序列测定及系统发育分析
• 1.10 分离菌株的底物降解谱试验
• 1.11 分离菌株在LB 培养基中的生长曲线
• 2 结果与讨论
• 2.1 二氯喹啉酸降解菌的形态特征
• 2.2 分离菌株F1 的生理生化鉴定
• 2.3 分离菌株F1 的16S rDNA 序列测定及系统发育分析
• 2.4 分离菌株 F1 的底物降解广谱性实验
• 2.5 二氯喹啉酸降解菌在LB 培养基中的生长曲线
• 3 小结
• 第三章 菌株F1 的降解特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要培养基
• 1.5 接种母液的制备
• 1.6 二氯喹啉酸浓度的测定方法
• 1.7 二氯喹啉酸起始浓度对F1 菌株生长和降解二氯喹啉酸的影响
• 1.8 温度对菌株F1 降解的影响
• 1.9 pH 值对F1 菌株生长和降解二氯喹啉酸的影响
• 1.10 F1 菌株生长和降解二氯喹啉酸之间的关系
• 1.11 外加碳源葡萄糖对菌株F1 生长和降解二氯喹啉酸的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 二氯喹啉酸起始浓度对F1 菌株降解二氯喹啉酸的影响
• 2.2 温度对F1 菌株降解二氯喹啉酸的影响
• 2.3 pH 值对F1 菌株降解二氯喹啉酸的影响
• 2.4 菌株 F1 以二氯喹啉酸为唯一碳源、氮源的生长曲线和二氯喹啉酸降解率之间的关系
• 2.5 外加碳源葡萄糖对菌株F1 生长和降解二氯喹啉酸的影响
• 3 小结
• 第四章 菌株F1 对土壤中二氯喹啉酸的降解
• 1 材料和方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 主要试剂与仪器
• 1.3 接种菌液制备
• 1.4 二氯喹啉酸在土壤中降解率的测定
• 1.5 不同接菌量对土壤中同一浓度二氯喹啉酸的降解
• 1.6 同一菌种量对土壤中不同浓度二氯喹啉酸的降解
• 2 结果与分析
• 2.1 不同接种量对土壤中同一浓度二氯喹啉酸降解的影响
• 2.2 同一接种量对土壤中不同浓度二氯喹啉酸降解的影响
• 3 小结
• 第五章 二氯喹啉酸胁迫对菌株F1 的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要培养基
• 1.5 接种母液的制备
• 1.6 邻苯二酚l, 2-双加氧酶的酶活分析
• 1.7 酶活测定
• 1.8 SDS-PAGE 供试菌体的培养与制备
• 1.8.1 对照组菌体的培养与制备
• 1.8.2 处理组菌体的培养与制备
• 1.9 菌体的全蛋白溶液制备
• 1.10 SDS-PAGE
• 1.12 菌体F1 的RNA 的提取
• 1.13 引物设计
• 1.14 RNA 反转录cDNA
• 1.15 PCR 扩增
• 2 结果与讨论
• 2.1 邻苯二酚双加氧酶酶活分析
• 2.2 菌株F1 的全蛋白质SDS 电泳分析
• 2.3 邻苯二酚1, 2-双加氧酶基因的扩增
• 2.4 邻苯二酚1, 2-双加氧酶基因的RT-PCR
• 3 小结
• 研究结论及展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• ABSTRACT