论文摘要
原发性肝癌是一种严重的世界性恶性肿瘤,在中国占癌症死亡率的第二位,临床诊断后平均生存时间不到12个月。在中国和日本,90%以上的肝癌为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）,75%80%的HCC发病与肝脏慢性病毒性感染有关,而且世界范围内80%90%的HCC患者合并有肝硬化。此外,据统计60%以上的癌症患者在初次诊断时就已出现转移,临床癌症患者约有80%～90%死于侵袭和转移。因此,在有病毒感染和肝硬化背景的人群中发现在肝癌早期可切除阶段即能检测到的诊断标志物尤为重要。但不幸的是,目前用于检测肝癌的肿瘤标志物在临床诊断中缺乏足够的灵敏度和特异性,并且不能判断患者是否已经出现远处转移。蛋白质组学作为全面分析蛋白质表达变化的有力研究工具,已广泛应用到疾病特别是肿瘤研究之中。定量分析是蛋白质组学研究的重要组成部分,对方法学有较高的要求,需要对生物样品之间的蛋白质差异表达值提供准确和重复性好的分析。ClinProt作为一种新的蛋白质芯片技术,它将本来在芯片上进行的样品纯化和富集过程改为用磁珠来完成,得到纯化和富集后的蛋白质既可用于生物标志物发现阶段的质谱分析,也可以用于生物标志物发现后的鉴定研究,克服了SELDI芯片技术的缺点。含有稳定同位素的氨基酸标记（stable isotope-labelled animo acids in cell culture, SILAC）是在培养细胞的过程中加入同位素标记（体内标记）,细胞经过有血清培养至一定数目时,换为无血清培养基进行短期培养,最后得到的培养上清中含有大量的胞外分泌蛋白质。该技术对无血清培养分泌蛋白质组表达谱分析和差异蛋白质组定量分析是肿瘤蛋白质组研究中的一项突破,为肿瘤早期诊断和复发转移监测的研究提供了一种新的方法。甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP）是目前最常用的HCC诊断标志物,但由于HCC组织中的癌细胞存在明显异质性,其中一部分癌细胞能合成分泌AFP,而另有一部分癌细胞从不分泌AFP,因而有超过30%的HCC患者即使到了中晚期血清AFP也表现正常或低阳性,因此,发现和验证适用于AFP阴性的HCC诊断标志物十分必要。此外,研究显示AFP阴性与AFP阳性癌细胞是HCC中两类不同的亚群,因此,我们在研究时将AFP阴性HCC作为标志物筛选对象,将减少研究材料方面的生物学干扰和提高诊断AFP阴性HCC的特异性,为后期该标志物与AFP联合使用从而在整体上提高HCC临床诊断效率提供手段。我们首先确定了ClinProt体系的重要技术参数:如以血清为分析材料、使用WCX磁珠、使用AnchorChip靶、选用1:10的样本/基质稀释比等,以获得最佳的质谱分辨率和灵敏度。在此基础上进行了质谱靶内不同点、不同处理批次和不同实验时间之间的重复性评价,结果表明该技术体系稳定可靠。然后用ClinProt技术总共检测了218例合格的临床血清标本。在诊断模型建立的训练集中,以HBV感染后AFP阴性HCC 28例为研究组,以HBV感染后肝硬化33例为对照组,建立了一个由五个蛋白质谱峰组成的AFP阴性HCC的诊断模型,该诊断模型对AFP阴性HCC和肝硬化诊断的灵敏度达到92.86%,特异性达到93.94%。在扩大样本（AFP阴性HCC 31例,AFP阳性HCC 21例,肝硬化30例,慢性肝炎35例和健康献血者30例）的检测集中,对AFP阴性HCC的灵敏度达91.67%,特异性达90.91%;对21例AFP阳性HCC的正确识别率为100%;其中,三个分子量分别为2467.83, 7757.73, 9277.89 Da的诊断峰在AFP阴性与AFP阳性HCC中均上调,在健康献血者、肝硬化与慢性肝炎中均下调。该诊断模型与原有HCC诊断标志物相比不仅特异性较高,而且其灵敏度明显提高,在AFP阴性HCC的临床诊断中具有良好的应用前景。经质谱鉴定,诊断模型中的三个上调蛋白峰分别对应为SERPINC1、Vitronectin和PRG4三个蛋白质。Vitronectin的上调表达与HCV相关HCC的血清SELDI分析一致,PRG4的上调表达为我们首次发现,并得到了临床血清样本的免疫印迹（Western blot, WB）验证和组织样本的免疫组化验证,为潜在AFP阴性HCC的血清标志物。肿瘤转移是导致癌症患者治疗失败和死亡最主要的原因。肿瘤侵袭转移过程涉及多个分子作用机制和信号转导途径,包括细胞的黏附分子、细胞外基质降解分子、生长因子、趋化因子和淋巴血管生成因子等。HCC的复发与转移监测是一个难点,目前临床尚缺少灵敏有效的肿瘤标志物。分泌蛋白能够决定、调控或参与细胞水平的生长、分裂、分化或凋亡等重要的生物学过程,并与机体整体水平的免疫防御、血液凝集和肿瘤形成与发展等密切相关。因而,分泌蛋白中含有很好的疾病治疗靶标或诊断与预后判断的标志分子。我们通过SILAC技术检测了MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM6三个转移能力依次增强的肝癌细胞株无血清培养的分泌上清,用LTQ-FT鉴定到了1,251个高可信、非冗余的蛋白质（95%可信度,双肽段）。通过MSQuant软件定量结合人工校正分析得到549个差异蛋白质（差异值Ratio≥1.5）。其中,在HL（MHCC97-H vs MHCC97-L）和ML（HCCLM6 vs MHCC97-L）中同时鉴定到并随转移能力逐步增强而规律性上调或下调的蛋白158个,仅在HL中鉴定到的差异蛋白210个,仅在ML中鉴定到的差异蛋白164个。因此,我们首次构建了肝癌转移相关分泌蛋白的表达谱和差异谱。其次,在全部分泌蛋白中有229个同时也在人血浆蛋白质组（HPP）核心数据集中被鉴定到,其中包括42个在HL和ML中同时鉴定到并呈规律性上下调的差异蛋白和33个仅在ML鉴定的差异蛋白,部分差异蛋白经生物信息学分析和临床血清标本验证,是潜在的转移相关诊断标志蛋白,为进一步的临床验证奠定了基础。根据生物学功能分类和文献调研,部分已知差异分泌蛋白为肿瘤转移中微环境的调整及基底膜的水解类分子、癌细胞的迁移与运动类分子、硫酸乙酰肝素聚多糖类（HSPG2）、基质金属蛋白酶类（TIMP2）及与消化道肿瘤转移相关的蛋白。同时还首次鉴定到许多未知功能的差异分泌蛋白,由于这部分差异分泌蛋白的表达丰度与其转移能力的表型密切相关,为进一步的癌症转移机制的相关功能研究和治疗靶标的筛选打下了基础。根据鉴定蛋白的打分值、SILAC定量的准确性、生物学意义和文献报道与肿瘤转移的相关性,选取了其中的三个上调蛋白（Clusterin,Lumican,HSPG2）与三个下调蛋白（Gelsolin,C3,IGFBP2）分别做了分泌上清和人体血清标本的WB生物学验证,四个蛋白质WB结果与SILAC定量结果基本一致。其中,Clusterin、Gelsolin和C3在不同转移状况的临床血清标本WB验证结果与患者是否出现转移表现出了很强的一致性,为肝癌转移相关诊断的候选标志蛋白。本研究首次利用一种转移能力逐步增强的细胞模型结合SILAC体内标记技术,对转移性肝癌的分泌蛋白质组进行了定量研究,结果表明该技术策略可以富集低丰度分泌蛋白质,避免高丰度蛋白质干扰,简化分析体系,实现潜在肿瘤标志蛋白的高通量发掘,并初步验证了三个转移性肝癌临床诊断的候选标志蛋白。