论文摘要
伴随着人类基因组计划的顺利实施，以基因芯片为先导的生物芯片技术得到了蓬勃的发展，在国际上引起了广泛的关注。基因芯片杂交技术需要准确预测配对碱基与非配对碱基的数目和种类。因而迫切需要一种灵敏、准确和便捷的检测手段与之相适应。目前，基因芯片信号检测中主要采用荧光检测法。但核酸本身不发荧光，检测前需要结合荧光标记物。这就存在标记不完全、靶标的非特异性吸附、荧光漂白、淬灭和背景干扰等缺点。此外，荧光谱带比较宽，不适合多重检测。比之于荧光检测，激光喇曼光谱方法无需样品标记，能够提供关于样品分子结构丰富的光谱信息，而且谱峰细锐，便于识别。加之，它几乎不受水溶液的干扰，特别适合于生物样品的检测。因此，激光喇曼光谱技术是一种很有应用前景的生物芯片检测方法。本文利用激光喇曼光谱技术测试了人工合成的多聚核苷酸PolyA、PolyU、PolyG和PolyC以及它们之间形成的一些复合物，并考查了复合物形成前后的光谱变化。实验发现，碱基互补的单链核酸之间形成复合物PolyA·PolyU和PolyG·PolyC之后喇曼光谱呈现出特征明显的变化。首先，表征A型主链构象的喇曼峰810cm-1-815cm-1相对强度增加，同时用于描述主链构象有序程度的R参量(R=I810／I1100)增大，说明与配对复合之前的无规卷曲或单链螺旋不同，复合物已经形成了双螺旋的结构形态；其次，相对于单链无规卷曲状态，双螺旋的形成使得1100 cm-1峰的半高宽变窄；再次，碱基互补配对双链的形成一方面使得表征氢键配位基团的结构发生重大改变，如Polyu和PolyC的羰基由原先的暴露状态变为“隐藏”，PolyG自体氢键解体。与氢键位点相关的基团振动频率也发生改变。另一方面它还使垂直的碱基—碱基堆积力大为增强，主链构象变得更为有序，从而产生了明显的喇曼减色效应并伴随着相关谱带的频移。另外，我们还对两种碱基错配的复合物进行了研究。结果发现非互补碱基之间同互补碱基一样也可以通过氢键相互作用。并且不同碱基之间形成复合物的喇曼光谱特征又各有千秋。这主要表现在：首先，虽然PolyG·PolyA和PolyA·PolyC都形成了双螺旋结构，表征A型螺旋结构的谱带分别落在810cm-1和806cm-1。但是后者还出现了表征B型结构的836cm-1峰。该峰的出现说明PolyA·PolyC不是典型的A型构象，而应定义为A／B兼型。其次，G-A复合物在1090cm-1附近出现了双峰，因此有两个R值与双螺旋中的两条链的有序程度相对应。形成该复合物之后，PolyG链产生了重大变化，PolyA链却几乎没有改变。而A-C复合物的情况则与互补配对的情形相似。再次，考察1099cm-1的半高宽，我们发现PolyA·PolyC在该处的线宽为33cm-1，与碱基互补复合物的相仿。然而PolyG·PolyA的则为61 cm-1，明显更宽，这可能与PolyG扭曲的主链有关。另外，A-C的复合导致了明显的“喇曼减色效应”。然而对于PolyG·PolyA，尽管有些谱带也表现出强度的减弱，但有许多表征碱基堆积的谱带强度，尤其是腺嘌呤的谱带非但没有减弱，反而有很大的增强。这也是G-A错配的一大特征。最后，这两种碱基错配的复合物氢键配位模式也很不同。A-C复合物中只含有一个碱基氢键；而G-A复合物除了两个碱基氢键配位点外，在碱基环与主链之间还存在一个氢键作用。实验结果不仅表明喇曼光谱对于研究核酸的氢键配位、主链构象和碱基堆积来说是一种强劲的工具。而且，鉴于喇曼光谱在反映分子结构的细微变化，无需标记、制样简便、测试快捷，谱峰细锐等方面的优越性，它可望成为一种很有发展前景的基因芯片检测技术。