三种鼠传疾病快速检测胶体金试纸条的研制

论文摘要

本研究采用胶体金免疫层析技术（GICA）,研制鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia Pestis;YP）、汉坦病毒（Hantavirus;HV）、钩端螺旋体（Leptospira; LP）快速检测试纸条,经过实验条件优选,使此检测方法操作简便、快捷、灵敏、特异、准确,提高技术含量,降低检测成本,使其适用于现场实地监测,达到及时准确地对3种鼠传疾病进行检疫、监测的目的。本研究对YP、HV和LP的抗原片断进行了优化选择,通过计算机分析同源序列确定了新的抗原位点。构建了由三种病原体共12个抗原位点（其中YP荚膜F1抗原位点2个、HV抗原位点5个、LP抗原位点5个）串联基因片段的表达载体pET-20b-rYHL及pET-20b-rYF、pET-20b-rHV、pET-20b-rLP,在原核表达载体系统中进行表达,纯化并鉴定其活性。纯化后rYHL蛋白经免疫家兔,制备多克隆抗体,随后采用GICA技术,制备鼠疫杆菌、汉坦病毒、钩端螺旋体一步法免疫胶体金快速检测试纸条。结果显示,rYHL及rYF、rHV、rLP四种重组融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可见与设计相对分子量相符的蛋白带,间接ELISA法检测具有良好的生物活性；rYHL重组融合蛋白免疫家兔得到多克隆抗体,ELISA实验显示制备的多克隆抗体效价稳定,与rYHL抗原能特异性结合；制备了直径约40nm的胶体金溶液,4℃条件下可稳定保存两个月以上,确定了胶体金溶液最佳pH值为7.0,确定了最适抗原标记量为100μg/mL,得到了免疫胶体金探针并进行了纯化；确定了胶体金试纸条的制备条件,制备了鼠疫、肾综合症出血热和钩端螺旋体病快速检测胶体金试纸条,具有良好检测效果。本研究成功构建了重组鼠疫耶尔森氏菌荚膜F1抗原、重组汉坦病毒抗原、重组钩端螺旋体抗原和重组鼠疫汉坦钩端优势抗原表达载体；对rYHL及rYF、rHV、rLP四种重组融合蛋白进行了表达、鉴定、纯化及活性测定；制备了重组鼠疫汉坦钩端优势抗原融合蛋白兔多克隆抗体；制备了胶体金溶液和免疫胶体金探针；制备了3种鼠传疾病的快速检测胶体金试纸条,通过试纸条的初步应用,表明其具有较高的特异性和敏感性,具有很好的应用前景。

论文目录

• 内容提要
• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 第1节 鼠疫耶尔森氏菌、汉坦病毒和钩端螺旋体及其所致疾病研究进展
• 1.1 鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia Pestis）
• 1.2 汉坦病毒（Hantavirus）
• 1.3 钩端螺旋体（Leptospira）
• 第2节 鼠疫、肾综合症出血热和钩端螺旋体病的检测方法研究进展
• 2.1 鼠疫检测方法研究进展
• 2.2 肾综合症出血热检测方法研究进展
• 2.3 钩端螺旋体病检测方法研究进展
• 第3节 胶体金免疫层析技术研究进展
• 3.1 胶体金免疫层析技术的原理
• 3.2 胶体金免疫层析技术的特点
• 3.3 胶体金免疫层析技术的应用
• 3.4 胶体金免疫层析技术的发展趋势
• 第2章 实验研究
• 第1节 抗原的制备鉴定及多克隆抗体制备
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第2节 胶体金及胶体金探针制备
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第3节 胶体金试纸制备及应用
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第3章 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 攻读博士学位期间取得的科研成果
• 致谢