论文摘要
目的尽管医学技术飞速发展,激素抵抗型前列腺癌（CRPC）的治疗仍然是临床治疗上面临的一大难题。CRPC的临床治疗目前可供选择的方法有限。虽然现有的化疗药物存在许多不足之处,但是化疗仍然是CRPC的一线治疗方法。目前急需开发新的CRPC化疗药物。在本研究中,我们将从体内实验、体外实验两方面对天然化合物维康醇的抗前列腺癌作用进行评估,并在此基础上,运用具有CRPC特性的前列腺癌细胞系模拟CRPC的生物学过程,进一步研究维康醇的药理作用机制。材料和方法我们选取了包括正常前列腺细胞、前列腺增生细胞、前列腺癌细胞在内的七种前列腺细胞系RWPE-1、LNCaP、C4-2、DU145、PC-3、BPH1和22RV1。通过台盼蓝染色检测细胞死亡。通过免疫组化、Western blot分析、流式细胞学分析、免疫共沉淀分析（IP）、DNA片段分析、JC-1染色分析和荧光分析检测各细胞信号通路标志物。建立PC-3和DU145细胞裸鼠皮下移植瘤模型,从动物水平评估维康醇的抗前列腺癌作用。结果维康醇诱导细胞死亡呈时间依赖性改变,且对肿瘤细胞具有相对的选择性。通过检测发现,维康醇可以造成细胞线粒体膜电位极化异常,线粒体细胞色素C向细胞浆释放,caspase-3、caspase-9和PARP活化,DNA出现碎裂,这些证据表明,维康醇诱导细胞死亡通过典型的细胞凋亡途径。Bax在维康醇处理后出现切割带。通过特异性siRNA下调Bax表达或者使用Bax通道特异性阻断剂可以有效地抑制维康醇诱导的细胞凋亡,这些证据表明Bax活化参与了维康醇诱导的细胞凋亡。随后,我们发现维康醇可以引起细胞活性氧（ROS）水平升高,且这一过程几乎可以被N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）完全阻断,同时,NAC也可以阻断维康醇诱导的细胞线粒体膜电位极化异常,线粒体细胞色素C向细胞浆释放,caspase-3、caspase-9和PARP活化,DNA碎裂。这些证据表明NAC阻断了维康醇诱导的细胞凋亡过程。动物实验表明维康醇能够抑制PC-3细胞裸鼠皮下移植瘤的生长并造成移植瘤细胞凋亡,而DU145细胞裸鼠皮下移植瘤未观察到这一现象。结论这些数据表明维康醇能够升高细胞ROS水平,并通过活化Bax依赖性内源性细胞凋亡途径诱导前列腺癌细胞凋亡。当然,要实现维康醇的临床应用还有待进一步的实验研究。目的阴茎海绵体平滑肌细胞和内皮细胞功能障碍是中老年男性勃起功能障碍（ED）的重要原因。补充VEGF可以通过多种机制达到改善阴茎海绵体平滑肌细胞和内皮细胞功能的目的。因此,增加VEGF的表达有望对ED起到改善作用。研究利用小分子RNA激活人阴茎海绵体平滑肌细胞VEGF基因表达,以探讨RNA激活技术治疗勃起功能障碍的可行性。材料和方法体外原代分离培养人阴茎海绵体平滑肌细胞。利用α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）免疫组织化学染色对人阴茎海绵体平滑肌细胞进行鉴定。化学合成针对人VEGF基因启动子的dsRNA序列（dsVEGF-706）和阴性对照dsRNA序列。分别用dsVEGF-706和阴性对照dsRNA转染人阴茎海绵体平滑肌细胞,并设立空白对照。利用real timePCR在mRNA水平上对人阴茎海绵体平滑肌细胞VEGF表达进行检测；利用western blot和免疫荧光分析在蛋白质水平上对人阴茎海绵体平滑肌细胞VEGF表达进行检测。结果转染72小时后,real time PCR检测显示dsVEGF-706转染组VEGF mRNA水平较阴性对照组和空白对照组显著升高（p<0.05）。进一步用western blot和免疫荧光染色检测显示,dsVEGF-706转染组VEGF蛋白表达显著升高,与mRNA水平实验结果相一致。结论在原代分离培养的人阴茎海绵体平滑肌细胞中,VEGF的表达可以通过RNA激活技术上调,表明利用小分子RNA激活VEGF表达有望成为勃起功能障碍基因治疗的新选择。