论文摘要
背景和目的:脑出血（Intracerebral Hemorrhage ICH）是脑血管病中的危急重症,死亡率、致残率较高。脑出血发生后,如何促进神经功能的恢复,至今尚缺乏有效的治疗措施。神经干细胞（neural stemcells,NSCs）是能自我更新、并能分化为脑组织细胞的细胞群,将神经干细胞移植到脑出血患者脑内,替代受损或死亡的神经细胞,促进神经功能的恢复,无疑具有巨大的临床应用价值。移植的神经干细胞多数情况下来源于同种异体,在一定条件下表达MHC分子,脑出血后血脑屏障损伤,脑的“免疫豁免”状态被破坏,移植排斥完全可能发生。移植成功必须首先避免排斥反应的发生。在移植免疫应答中,T淋巴细胞亚群分泌的细胞因子发挥着不同作用。其中Th1型细胞因子（IL2、IFN-γ等）参与介导排斥反应;Th2型细胞因子（IL-4、IL-10等）可拮抗Th1细胞并抑制CTL细胞的功能,从而诱导免疫耐受。因此,阻断Th1细胞及其所分泌细胞因子的效应或增强Th2细胞及其所分泌的细胞因子的效应,有利于建立移植耐受。妊娠属于生理性的“同种异体移植”,若母体产生以Th1为主的免疫应答,则胎儿容易被排斥,造成流产。对于流产,祖国医学有丰富的治法,并具有独特的疗效。中药复方泻火补肾汤即根据《医学衷中参西录》中保胎验方一寿胎丸化裁而来。我们推测,根据中医保胎理论而设的泻火补肾汤同样应具有增强Th2细胞/阻断Th1细胞效应的作用,从而诱导免疫耐受,抑制干细胞移植排斥。本实验从Th1/Th2偏移（Th1/Th2 shift）入手,观察脑出血大鼠行NSCs移植,经泻火补肾汤干预后,脑内IFN-γ及IL-4的表达,探讨泻火补肾汤能否确切诱导免疫耐受及其可能机制。方法:用新生SD幼鼠脑分离、培养神经干细胞,经过鉴定、传代及用BrdU标记。对移植受体大鼠进行群体反应抗体（panel reactiveantiboay,PRA）测定,筛选PRA值阳性大鼠180只随机平均分为6组:正常组、模型组、假手术组、泻火补肾汤组、移植组、移植治疗组。用Ⅶ胶原酶经脑内立体定位注入大鼠右侧苍白球（前囟后1.40mm,矢状缝右3.20mm,深5.60mm）内复制大鼠脑出血模型,移植组、移植治疗组于造模后第二天后立体定位将标记的NSCs移植入同侧侧脑室下区（前囟前1.6mm,矢状缝右侧1.2mm,深4.0mm）。泻火补肾汤组、移植治疗组予泻火补肾汤（17.1g/kg.d,相当于70kg成人剂量的6倍）灌胃。在灌胃2d、7d、14d、21d、28d后麻醉大鼠,每组各取6只大鼠脑组织,其中3只采用PCR法检测脑内IFN-γ及IL-4mRNA表达;另3只采用免疫组化法观察IFN-γ及IL-4时空分布规律。结果:1、神经干细胞的分离、鉴定:采用机械分离法从SD幼鼠脑组织分离的细胞培养至第7天时可形成大量的神经球,免疫荧光鉴定为BrdU、nestin阳性。证明为神经干细胞。2、PRA值测定:CDC实验显示显微镜下淋巴细胞形态大致可分为两种:体积明显增大,折光性极弱,如“煤球状”（细胞死亡）或体积无明显变化,折光性强,如“星星状”（细胞存活）。计数死活细胞数得出PRA值,以PRA值＞10%为致敏,10%～40%为中敏,＞40%为高敏,筛选出致敏阳性大鼠,进行移植实验。3、免疫组化检测IFN-γ/IL-4表达显示:正常组、假手术组未见IFN-γ、IL-4表达,其他各组组2d即可见IFN-γ表达,并达高峰,7d表达逐渐减弱.移植治疗组从第7天开始表达低于模型组与移植组（P＜0.05）,并持续至第28天。IL-4在脑出血组和移植组各时间点几乎未见表达,在移植治疗组2d时亦未见分布,7d时开始少量表达,14d达到高峰并持续至21d,第28天较前稍有减少,其表达仍高于移植组（P＜0.01）。4、大鼠脑内IFN-γ及IL-4mRNA表达特点:正常组、假手术组IFN-γ及IL-4mRNA极少量表达;模型组、泻火补肾汤组、移植组及移植治疗组IFN-γmRNA表达2d达最高峰,随后表达均逐渐减弱;泻火补肾汤组表达始终低于模型组、移植组及移植治疗组（P＜0.05）2d时移植治疗组与模型组表达差异无显著性（P＞0.05）,自7d起移植治疗组IFN-γmRNA表达开始低于模型组（P＜0.05）,并明显低于移植组（P＜0.01）;IL-4mRNA在模型组、泻火补肾汤组极少表达,各时间点比较差异无显著性（P＞0.05）,移植治疗组IL-4mRNA表达逐渐增强,第7d达到高峰,与模型组及移植组比较差异有显著性（p＜0.05）。结论:1、以PRA值为标准筛选移植受体大鼠,是本实验创新点,同具有简便、高效、准确的特点,简化了实验步骤,极大提高了筛选实验大鼠的效率。2、泻火补肾汤能影响移植大鼠脑内IFN-γ与IL-4的基因及蛋白表达,即下调IFN-γ而上调IL-4,诱导Th细胞向Th2漂移,从而有助于诱导免疫耐受,抑制移植排斥的发生。
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