论文摘要
第一部分HIF及其靶基因在5/6肾切除大鼠中的动态改变研究背景和目的近20年来,肾小球高灌注、高滤过一直被认为是CKD进展的主要共同机制。然而,近年的动物实验和临床研究表明,多种病因导致的CKD普遍存在肾小管间质的缺血缺氧;在各种肾脏疾病（包括肾小球疾病）进展中,肾小管间质损伤的作用比肾小球损伤更为重要,而慢性缺血缺氧可能就是小管间质病变进行性发展的共同机制。然而,上述有关缺氧和CKD的研究仅局限在疾病的早期和中期阶段,终末期肾病是否存在缺氧目前尚未见报道。HIF是细胞氧自稳态的重要调节因子。缺氧后HIF的稳定高表达是机体做出的重要适应性反应。PHD是在蛋白水平调节HIF-α,表达的关键酶。研究表明PHD2和PHD3可能也是HIF的靶基因,且在慢性持续缺氧条件下二者可能通过负反馈作用下调HIF-α的表达,直至达到新的调定点平衡。本研究欲采用典型的CKD动物模型—5/6肾切除模型,研究缺氧在整个CKD进展中的情况,并进一步验证在CKD的进展过程中,是否也存在一个HIF-PHD-氧敏感系统。方法选用体重180-200g雄性SD大鼠,二步法5/6肾大部切除术建立CKD大鼠模型。大鼠右肾切除术后第1周末,选取存活的大鼠随机分为1wk,2wk,4wk,6wk,8wk和12wk组,分别于1、2、4、6、8和12周末处死,处死前测定血压,并留取血、尿和肾组织标本,比较各组大鼠血压、肾功能、24h尿微量白蛋白水平、组织病理变化和缺氧状况的差异,同时测定残肾皮质中HIF-1α、HIF-2α以及它们的下游靶基因VEGF、HO-1、Glut-1、Epo以及PHD2、PHD3等的mRNA水平和蛋白水平。结果1.残肾的一般特征。肾切除后第1周出现了短暂的急性肾衰竭（CTL 23.41±2.79vs week1 122.78±22.13,μmol/l,P＜0.01）,之后进入稳定的慢性肾衰竭阶段,Scr从第2周的66.0μmol/L逐渐进展为第12周的117.4μmol/L。残肾组大鼠在术后第1周末即出现明显的蛋白尿(Ualb:week1 1.73±0.55 vs CTL0.35±0.09,g/24h,P＜0.01),而尾动脉收缩压也在术后迅速升高,于第8周达到高峰（CTL 98.03±2.73 vs week8 177.25±14.46,mmHg,P＜0.01）。2.小球硬化和小管间质损伤。从术后第4周开始残肾皮质出现明显的系膜区增宽和毛细血管袢的闭塞、玻璃样变（肾小球硬化指数:CTL 0.01±0.01 vs week40.92±40.13,P＜0.01）;残余肾小管的增生和代偿性肥大始于术后第1周（小管间质损伤指数:CTL 0.01±0.01 vs week1 0.13±0.07,P＜0.01）,并于术后第4周开始出现局灶的小管萎缩、扩张和间质纤维化（week4:0.56±0.09）,此后进行性加剧（week12.4.93±0.57）。3.残肾缺氧状况。肾大部切除后第1周即出现小管细胞缺氧（免疫组化半定量评分CTL 0.45±0.69 vs week1 2.15±0.74,P＜0.01）;至第4和第6周,皮质小管缺氧达到高峰（week4 3.5±0.89和week6 3.154±1.2）;终末期时小管萎缩和间质纤维化非常严重,但组织缺氧仍然存在（week12:2.15±0.99）。4.残肾管周毛细血管分布。肾切除术后第1周,管周毛细血管已有狭窄或扭曲,至第8周和第12周,管周毛细血管数量明显减少（CRI:CTL 10.1±2.08 vsweek8 57.3±6.0,week12 78.6±9.0,P＜0.01）。5.HIF-α亚单位在残肾皮质中的分布。残肾皮质中HIF-1α仅在萎缩扩张的肾小管上皮细胞表达;HIF-2α则主要表达于内皮细胞,包括肾小球毛细血管袢内皮细胞和管周血管内皮细胞,此外管周的成纤维细胞和小动脉的血管平滑肌细胞也有表达。6.残肾皮质中HIF-α亚单位的表达变化。蛋白水平方面,在残肾早期阶段（第1周和第2周）,HIF-1α和HIF-2α表达即开始增加（HIF-1α:CTL 2.5±0.9 vsweek1 10.6±2.1,week2 14.6±4.1,P＜0.01:HIF-2α:CTL 3.1±0.5 vs week115.4±4.2,week2 17.4±5.1,P＜0.01）:随着Scr的增加和病理损伤的加重,至第4和第6周时,二者表达达到峰值（HIF-1α:week4,19.9±2.1,week624.6±4.2;HIF-2α:week4 24.6±4.2,week6 26.1±3.5）;此后表达逐渐下降,（week12,HIF-1α和HIF-2α:6.4±2.8和4.5±1.9）。但HIF-1α和HIF-2α在整个病程中都没有出现mRNA水平上的明显变化。7.残肾模型中HIF靶基因的表达。除术后第4周以外,残肾模型皮质VEGFmRNA水平均显著低于假手术组;HO-1在肾切除术后即刻表达就明显增加,但术后第2周迅速恢复至基线水平,再次升高是在术后第4和第6周;肾切除术后各时间点EPO的表达均高于假手术组,特别是术后第4和第6周;而Glut-1在术后前6周的表达也是明显高于CTL组的。采用免疫组化方法测定的上述指标的蛋白含量变化与mRNA水平变化相同。8.残肾模型中PHDs的表达。PHD2和PHD3 mRNA表达增加最早见于术后第1周,至术后第4和第6周达到高峰,此后略有下降但持续高表达。采用Western blot方法测定的上述指标的蛋白含量变化与mRNA水平变化相同。结论1.5/6肾切除术后12周内血压、蛋白尿、BUN和Scr等指标随病程进展进行性恶化,且12周时小管萎缩、间质纤维化等小管间质病变已相当严重,因此观察期为12周的残肾模型可以很好地动态研究CKD的早期、进展期和终末阶段的病情变化。2.缺氧贯穿于CKD的整个阶段,以肾切除术后第4周和第6周残肾皮质缺氧最明显,主要是局灶增生、肥大的肾小管上皮细胞区;即使是终末期,缺氧仍然持续存在。3.在CKD的进展过程中,早期的缺氧通过抑制PHDs的活性,使HIF-α亚单位得以表达增加;随着缺氧的持续,作为靶基因的PHDs又被表达增加的上游转录因子HIF所转录而继发性表达增加,这又反过来促进了HIF的降解,由此形成负反馈循环,并最终达到HIF-α、PHDs和氧三者的新的调定点平衡。4.建立HIF-a、PHDs和氧的新的调定点平衡的生理意义值得进一步研究。第二部分PHD抑制剂稳定HIF对延缓5/6肾切除大鼠慢性肾病进展的作用和机制研究背景和目的HIF是细胞氧自稳态的重要调节因子,其高表达是机体对缺氧做出的重要适应性反应,因此诱导HIF稳定持续高表达对延缓CKD的进展可能有重要意义。近几年来国内外研究HIF生物学作用的经典药物是二氯化钴（COCl2）,采用COCl2预处理可以减轻鼠的I/R损伤,而且钴对包括5/6肾切除、Thy-1肾炎和糖尿病肾病等慢性进展性肾病都有不同程度的形态学上的保护作用。虽然如此,钴本身的毒性却限制了它可能的临床应用。PHDs抑制剂可以有效地不依赖氧地稳定和活化HIF。L-mimosine（L-Mim）就是这样一种PHDs抑制剂。已证实L-Mim也可以减轻肾脏I/R损伤,有效的上调肾组织HIF-α的表达,副作用小,因此本实验选取L-Mim这种PHDs抑制剂作为治疗药物研究稳定HIF对延缓CKD进展的作用。我们前一部分的研究已发现,伴随组织细胞的持续缺氧,HIF在残肾大鼠中经历了先低后高再低的动态改变,并最终达到新的HIF、PHDs和氧的调定点平衡,提示在疾病的早期、进展期和终末期等不同时间段,采用PHD抑制剂稳定HIF对延缓CKD进展可能有不同的作用。此外,近期研究又发现,长期的HIF活化可促纤维化,促使EMT和诱发炎症反应,其作用可能是不利的。本研究将同时对长期HIF活化所可能带来的不利影响进行研究分析。方法选用体重180-200g雄性SD大鼠,二步法5/6肾大部切除术建立CKD大鼠模型。大鼠右肾切除术后1周末,选取存活的大鼠随机分为L-Mim早期治疗组（治疗时间为术后第1周末至12周末）、L-Mim进展期治疗组（治疗时间为术后第4周末至12周末）、L-Mim晚期治疗组（治疗时间为术后第8周末至12周末）和未治疗残肾对照组。L-Mim剂量为50mg/Kg/d,隔日上午8:30-9:30腹腔注射给药,术后12周末处死大鼠留取标本。比较各组大鼠血压、Hb、肾功能、24h尿alb水平、肾组织病理变化和缺氧状况差异,同时测定残肾皮质中HIF-1α、HIF-2α以及它们的下游靶基因VEGF、HO-1、Glut-1以及PHD2、PHD3等的蛋白水平。结果1.不同时机L-Mim治疗后残肾一般情况改变。早期治疗组Scr和24hUalb水平明显高于对照组(Scr[μmol/L]:165.6±10.7 vs 23.4±2.8:24hUalb[g/d]:292.0±52.2 vs167.8±49.2;P＜0.01),而BUN、Hb和血压等指标与对照组无差异（BUN[mmol/L]:30.0±2.9 vs 33.4±4.0;Hb[g/L]:97.4±8.0 vs 100.2±7.6;Bp[mmHg]:145.8±16.5 vs 147.3±15.4;P＞0.05）,但小管萎缩、扩张和间质纤维化等小管间质损伤情况较对照组严重（小球硬化指数:3.3±0.2 vs 3.1±0.3,P＜0.05;小管间质损伤指数:5.2±0.3 vs 4.9±0.6,P＜0.05）;进展期治疗组的BUN、Scr和24Ualb均明显低于对照组(BUN[mmol/L]:16.7±2.7 vs 33.4±4.0;Scr[μmol/L]:82.4±6.3 vs 23.4±2.8;24Ualb:68.6±8.9 vs 167.8±49.2,P＜0.01),Hb高于对照组（118.6±12.7 vs 100.2±7.6,P＜0.05）,Bp与对照组无差异（142.4±18.3 vs 147.3±15.4,P＞0.05）,而小管间质损伤较对照组有改善（3.0±0.3 vs 4.9±0.6,P＜0.01）;晚期治疗组上述各项指标与对照组无差异。2.L-Mim治疗对HIF-α亚单位在残肾皮质表达的影响。早期L-Min治疗后残肾大鼠萎缩扩张的肾小管上皮细胞HIF-1α表达量较对照组明显增加（32.6±6.7vs 6.4±2.8,P＜0.01）,且这些小管多位于间质纤维化明显的区域;此时HIF-2α表达也明显增加（36.7±6.8 vs 6.4±2.8,P＜0.01）,且以间质细胞为主,集中于纤维化明显的区域。进展期L-Min治疗组HIF-1α和HIF-2α核染色也较对照组明显增加（HIF-1α:19.4±5.2 vs 6.4±2.8;HIF-2α:19.6±6.4 vs 6.4±2.8;P＜0.01）,且其分布与早期治疗组类似,但总表达量较之略低。晚期L-Min治疗组二者的表达则与对照组无差异（HIF-1α:5.9±3.1 vs 6.4±2.8;HIF-2α:6.9±2.8 vs 6.4±2.8,P＞0.05）。各组肾皮质组织Western blot检测也证实了上述结果。3.L-Mim治疗对残肾皮质PHDs表达的影响（Western bolt结果）。早期和进展期L-Min治疗组PHD2和PHD3的表达均较对照组增加,且以早期治疗组增加更为明显,晚期治疗组二者的表达与对照组无差异。4.L-Mim治疗对HIF靶基因在残肾皮质表达的影响。进展期L-Min干预可以增加残肾皮质VEGF、HO-1和Glut-1的表达。早期L-Min治疗不能上调VEGF和HO-1这两个靶基因的表达,但却上调了Glut-1表达。晚期L-Min治疗组上述靶基因的表达与对照组无差异。5.L-Mim治疗对残肾皮质纤维化的影响。与残肾对照组相比,早期L-Min治疗组collagenⅢ含量明显增加（4.56±0.98 vs 3.11±0.69,P＜0.01）,相应的α-SMA和TGF-β1表达也明显增加（α-SMA:3.42±0.98 vs 2.88±0.59;TGF-β1:3.5±0.19vs 3.13±0.28,P＜0.05）。而进展期L-Min治疗后残肾collagenⅢ含量减少（2.47±0.54 vs 3.11±0.69,P＜0.05）,α-SMA和TGF-β1表达也有所减少（α-SMA:2.03±0.66 vs 2.88±0.59;TGF-β1:2.14±0.19 vs 2.88±0.59,P＜0.01）。晚期L-Min治疗后的残肾组织上述指标表达均与对照组无差异（collagenⅢ:3.23±0.63 vs 3.11±0.69;α-SMA:2.7±0.58 vs 2.88±0.59;TGF-β1:2.89±0.21vs 3.13±0.28,P＞0.05）。6.L-Mim治疗对残肾皮质血供的影响。早期治疗组CRI与残肾对照组无差异（85.9±8.6 vs 78.6±9,P＞0.05）。进展期L-Min治疗有效地减轻了残肾管周毛细血管的丢失,其CRI明显低于对照组（50.4±6.9 vs 78.6±9,P＜0.01）。晚期L-Min治疗组的CRI与残肾对照组亦无差异（75.8±8.6 vs 78.6±9,P＞0.05）。7.L-Mim治疗对残肾皮质缺氧情况的影响。早期L-Min治疗组pimonidazole阳性染色面积大于残肾对照组（2.7±0.89 vs 2.15±0.99,P＜0.05）。进展期治疗组pimonidazole阳性染色虽然大于残肾对照组（3.05±0.92 vs 2.15±0.99,P＜0.05）,但与早期治疗组无差异（P＞0.05）。晚期治疗组缺氧情况与对照组无差异（2.06±0.68 vs 2.15±0.99,P＞0.05）。8.L-Mim治疗对残肾皮质炎症的影响。早期L-Min治疗后间质ED-1阳性细胞浸润较对照组更为明显（87.8±7.9 vs 61.0±7.6,P＜0.01）,而进展期L-Min治疗组残肾间质阳性细胞浸润较对照组明显减轻（37.4±5.3 vs 61.0±7.6,P＜0.01）,晚期L-Min治疗组阳性细胞浸润与对照组无差异（65.8±7.1 vs61.0±7.6,P＞0.05）。结论1.早期L-Min治疗（术后1wk-12wk）将进一步恶化肾功能,加重小管间质纤维化;这可能与HIF-α亚单位长期过度高表达致纤维化相关靶基因选择性表达增加有关。2.进展期L-Min治疗（术后5wk-12wk）可以改善肾功能和贫血、减轻蛋白尿和小管间质损伤,这与适时的L-Min治疗稳定HIF-α亚单位、促进下游保护性靶基因VEGF和HO-1等继发性表达增加有关。3.CKD终末期肾脏损伤不可逆转。晚期L-Min治疗（9wk-12wk）不能延缓慢性肾病进展,且对HIF-α亚单位及其靶基因无影响。
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