利用RNAi抑制小鼠胎儿成纤维细胞中FGF5基因的表达

论文摘要

本研究运用了RNA干扰技术对eGFP转基因小鼠胎儿成纤维细胞中的FGF5基因进行了干扰。首先针对小鼠FGF5 mRNA的第316～335bp区域、第499～518bp区域和第766～785bp区域分别设计了发夹式RNA干扰片段,经合成和退火后,连接到pSilencer 3.0-H1载体上,再把H1和干扰片段一同酶切下来,并将带有H1启动子的干扰片段连接到红色荧光表达载体pCDsR上,分别命名为pCDsR-shRNA316（VⅠ）、pCDsR-shRNA499（VⅡ）、pCDsR-shRNA766（VⅢ）。同时对eGFP转基因小鼠胎儿成纤维细胞进行原代培养,并将干扰载体以脂质体介导法转染细胞,收集转染后的细胞提取总RNA,并反转录成cDNA。用SYBR GREENⅠ荧光定量PCR方法对转染了不同干扰载体的细胞cDNA进行检测,结果为:VⅠ干扰载体转染到细胞后,FGF5的表达量降低6.7倍;VⅡ干扰载体转染到细胞后,FGF5的表达量降低12.5倍;VⅢ干扰载体转染到细胞后,对FGF5的表达没有显著的影响。结论是小鼠FGF5 mRNA中,第766～785bp区域不是有效干扰区域;第316～335bp区域和第499～518bp区域是有效干扰区域,其中第499～518bp区域是最合适的干扰区域。本实验结果为今后针对其他因子的RNAi干扰和基因功能研究提供了研究基础,并为建立转基因干扰小鼠模型创造了条件。

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摘要

ABSTRACT

英文缩略词

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 RNAi干扰FGF5基因的红色荧光表达载体pCDsR-shRNA的构建

1.2.2 eGFP转基因小鼠中FGF5基因沉默效果的检测

2 结果与分析

2.1 RNAi干扰FGF5基因的红色荧光表达载体pCDsR-shRNA的构建结果

2.1.1 pSH1-shRNA载体的构建结果

2.1.2 红色荧光表达载体pCDsR-shRNA及阳性对照载体的构建结果

2.2 eGFP转基因小鼠中FGF5基因沉默效果的检测结果

2.2.1 eGFP转基因小鼠胎儿成纤维细胞的培养与生长曲线图

2.2.2 干扰载体转染eGFP转基因小鼠胎儿成纤维细胞结果

2.2.3 SYBR GREEN Ⅰ荧光定量PCR法检测结果

2.2.4 荧光定量PCR结果图

3 讨论

4 结论

参考文献:

文献综述

第一章 RNAi在哺乳动物中的应用

一、RNAi的发现

二、RNAi的可能机制

三、shRNA的实验原理

四、RNAi的研究进展

第二章荧光定量PCR技术的原理与应用

一、荧光定量PCR的原理

（一）荧光定量PCR的方法

（二） Real Time PCR检测系统

（三）荧光定量PCR的特点

二、荧光定量PCR实验方法

（一）绝对定量解析方法

（二）相对定量解析方法

（三）实验方法

参考文献:

致谢

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