水稻几丁质酶基因的克隆与表达

论文摘要

本研究以水稻幼嫩叶片为材料,提取水稻基因组DNA,以其为模板利用PCR技术扩增得到水稻几丁质酶基因chAB和ch24。分别将其克隆到载体pUC18-T上,并进行测序。chAB长为861bp,属于几丁质酶classⅢ;ch24长为972bp,属于几丁质酶classⅠ。将chAB和ch24分别克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组原核表达载体pAB-32a和p24-32a。通过正交试验优化得到pAB-32a重组蛋白的最佳表达条件为0.6mM IPTG诱导浓度,培养基pH7.0,30℃下200rpm培养5h;p24-32a重组蛋白的最佳表达条件为0.6mM IPTG诱导浓度,培养基pH6.0,35℃下200rpm培养6h。重组蛋白主要以包涵体形式存在。通过尿素梯度透析复性法对pAB-32a及p24-32a重组蛋白的包涵体进行复性,复性后的比活力分别为0.17U/mg和0.12U/mg。体外抑菌实验表明, pAB-32a和p24-32a的重组蛋白对水稻纹枯病菌（R. solani sclerotia）有较弱抑菌作用。为实现几丁质酶基因的分泌性表达,将chAB和ch24两个基因分别连接到表达载体pMBP-P上,构建原核表达载体pAB-MBP（P）和p24-MBP（P）。实验表明两个重组蛋白最佳IPTG诱导浓度都是0.6mM,pAB-MBP（P）和p24-MBP（P）的重组蛋白对水稻纹枯病菌（R. solani sclerotia）抑菌效果较明显。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 植物几丁质酶
• 1.1.1 植物几丁质酶的分类
• 1.1.2 植物几丁质酶的特性
• 1.1.3 植物几丁质酶的基因结构
• 1.1.4 植物几丁质酶基因的诱导表达与调控作用
• 1.1.5 植物几丁质酶在植物病害防治方面的应用
• 1.1.6 植物几丁质酶研究的新成果
• 1.2 几丁质酶的应用及研究前景
• 1.3 研究的目的和意义
• 2 材料方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 水稻
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水稻几丁质酶基因chAB 和ch24 的克隆及序列分析
• 2.2.1.1 水稻基因组DNA 的提取
• 2.2.1.2 水稻几丁质酶基因chAB 和ch24 的扩增
• 2.2.1.3 PCR 产物的纯化
• 2.2.1.4 克隆载体pUC18-T的制备
• 2.2.1.5 感受态细胞的制备
• 2.2.1.6 连接与转化
• 2.2.1.7 阳性克隆的鉴定
• 2.2.1.8 序列分析与蛋白质三维结构模型的构建
• 2.2.2 表达载体pAB-32a 和p24-32a 的构建与表达
• 2.2.2.1 pAB-32a 和p24-32a 表达载体的构建
• 2.2.2.2 pAB-32a 和p24-32a 的诱导表达
• 2.2.3 pAB-32a 和p24-32a 目的基因表达条件的优化及蛋白的复性与纯化
• 2.2.3.1 重组蛋白表达条件的优化
• 2.2.3.2 重组蛋白的复性与纯化
• 2.2.3.3 重组蛋白体外抑菌
• 2.2.4 表达载体pAB-MBP （P）和p24-MBP （P） 的构建与表达
• 2.2.4.1 构建表达载体
• 2.2.4.2 表达载体的诱导表达
• 2.2.4.3 重组蛋白体外抑菌
• 3 结果与分析
• 3.1 目的基因chAB、ch24 的克隆、测序及序列分析
• 3.1.1 水稻基因组的提取结果
• 3.1.2 获取目的基因的 PCR 结果
• 3.1.3 重组质粒pCHAB 和pCH24 的鉴定结果
• 3.1.4 序列分析与蛋白质三维结构模型的构建
• 3.2 pAB-32a 与p24-32a 表达载体的构建与表达
• 3.2.1 载体pET-32a 和PCR 产物chAB、ch24 双酶切结果
• 3.2.2 重组质粒pAB-32a 和p24-32a 的鉴定
• 3.2.3 表达载体pAB-32a 和p24-32a 的诱导表达
• 3.2.4 pAB-32a 和p24-32a 表达条件的正交优化
• 3.3 表达载体pAB-MBP （P） 和p24-MBP （P） 的构建与表达
• 3.3.1 构建表达载体
• 3.3.2 构建表达载体的鉴定
• 3.3.3 表达载体pAB-MBP （P） 和p24-MBP （P） 诱导表达
• 4 讨论
• 4.1 水稻几丁质酶基因chAB 和ch24 的克隆及表达载体的构建
• 4.2 包涵体的处理及复性
• 4.3 重组蛋白活性及抑菌效果
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录