慢病毒介导GDNF在BMSCs中的表达及其对乳胞素所致帕金森病模型的保护作用

论文摘要

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是发病率仅次于阿尔采默病的神经系统变性病，其发病机制至今尚不明确。帕金森病以黑质细胞脱失，残存的黑质细胞胞浆内出现Lewy小体为特征性病理损害。Lewy小体形成可能与黑质细胞泛素—蛋白酶体（Ubiquitin-Proteasome System，UPS）功能减退，削弱了对α-synuclein等胞内蛋白的降解与清除有关。在帕金森病患者黑质发现有蛋白酶体功能减退；蛋白酶体相关酶类的基因突变可以引起家族性帕金森病。这些结果都提示蛋白酶体功能减退参与了帕金森病的发病。乳胞素（Lactacystin）是链酶菌素的代谢物，对蛋白酶体的20S颗粒有选择性、不可逆抑制作用。本课题组已建立Lactacystin所致的帕金森病偏侧大鼠模型。在此基础上，我们继续探讨如何减轻蛋白酶功能减退引起的多巴胺能神经元损伤。我们以Lactacystin干预PC12细胞和立体定向注射大鼠右侧内侧前脑束（Middle Forebrain Bundle，MFB）为模型，研究过表达胶质细胞源性营养因子（Glial-cell Derived Neurotrophic Factor，GDNF）的骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs）的保护作用。第一部分GDNF慢病毒表达载体的构建及病毒的生产目的建立GDNF慢病毒表达质粒，并在293FT细胞中合成和收获病毒，同时测定病毒滴度。材料与方法：以pCDNA-GDNF为模板，设计含酶切位点的上下游引物，将扩增的PCR产物和pLenti6／V5-LacZ进行BamH I，Xho I双酶切，将酶切产物以T4连接酶连接。转化后挑选正确的克隆酶切鉴定，经测序证实表达载体构建正确。以脂质体转染法将GDNF和包装质粒共同转染293FT（以LacZ表达质粒为阳性对照），72h后收获病毒离心过滤，最后超速离心将沉淀重悬得到病毒储存液。以BMSCs测定病毒滴度。结果：经酶切和测序鉴定，pLenti6╱V5-GDNF序列正确，与病毒标志肽段V5融合表达。经293FT细胞包装后收获了病毒储存液，病毒滴度分别为GDNF（5.6×105TU／ml），LacZ（4.3×105TU／ml）。结论：成功构建了GDNF慢病毒表达质粒，并生产了具有感染能力的病毒储存液。第二部分慢病毒介导GDNF在BMSCs中的表达及其对Lactacystin引起PC12细胞损伤的保护作用目的：将携带GDNF基因的慢病毒转导至BMSCs，检测其过表达水平，并探讨过表达GDNF能否保护蛋白酶抑制剂（Lactacystin）引起PC12细胞的损伤。材料与方法：携带GDNF的慢病毒以MOI=1感染BMSCs后，利用RT-PCR、ELISA和免疫细胞化学方法检测GDNF的表达水平。利用MTT法检测GDNF-BMSC细胞培养上清预处理PC12能否减轻Lactacystin引起的损伤。结果：GDNF-BMSCs经RT-PCR和免疫细胞化学证实有外源性GDNF表达，且感染率达95％以上。ELISA检测显示感染病毒后24h开始，上清中GDNF含量较BMSCs组显著增高（P值＜0.001），72h达到800pg／ml。GDNF-BMSCs培养上清对Lactacystin（10μm）引起的PC12的损伤有保护作用（P值=0.0004）。结论：慢病毒介导的GDNF能高效感染骨髓基质细胞，分泌具有生物学活性的GDNF，减轻Lactacystin引起的PC12细胞损伤。第三部分GDNF-BMSCs基因工程细胞移植治疗Lactacystin所致偏侧PD大鼠模型的模型目的：探讨预移植GDNF-BMSCs基因工程细胞对Lactacystin所致偏侧PD大鼠模型的保护作用。材料与方法：取雌性SD大鼠64只，随机分为对照组、lactacystin组、LacZ-BMSCs移植组（LacZ组）和GDNF-BMSCs组（GDNF组）。LacZ组和GDNF组于右侧纹状体四点注射2×105个基因工程细胞，对照组和lactacystin组注射0.01M PBS（20μl），细胞移植1周后，在lactacystin组和LacZ组、GDNF组大鼠右侧MFB立体定向注射lactacystin 2μg，NS组注射等量的生理盐水。观察大鼠行为变化、黑质致密区（SNc）TH阳性细胞数、纹状体TH阳性纤维灰度、黑质TH免疫印迹、以及纹状体区多巴胺含量。结果：GDNF组和LacZ组大鼠阿朴吗啡诱导的旋转次数显著低于Lactacystin组（P＜0.05）。GDNF组和LacZ组纹状体TH阳性纤维和SNc区TH阳性神经元显著高于Lactacystin组（P＜0.05），GDNF组SNc区TH阳性神经元高于LacZ组（P值＜0.05）。免疫印迹结果显示，lactacystin组右侧TH表达显著低于左侧，而GDNF组无显著变化（P=0.361），LacZ组有明显减低（P＜0.05），但仍高于Lactacystin组（P=0.023）。GDNF组（25.53±16.18 pmol／mg总蛋白，P=0.0016）和LacZ组（20.71±17.78 pmol／mg总蛋白，P=0.025）右侧纹状体多巴胺含量显著高于Lactacystin组（1.01±1.29 pmol／mg总蛋白）。结论：GDNF-BMSCs和LacZ-BMSCs工程细胞移植能减轻Lactacystin引起的中脑黑质多巴胺能神经元的损伤，GDNF-BMSCs的保护作用优于LacZ-BMSCs。结论1．构建了GDNF慢病毒表达载体，经293FT细胞包装生产了具有感染能力的病毒颗粒。2．GDNF慢病毒感染骨髓基质细胞后过表达，分泌至上清中的GDNF达到800pg／ml。该上清能减轻蛋白酶抑制剂Lactacystin引起的PCI2细胞的损伤，具有神经保护作用。3．经MFB局部立体定向注射2μg Lactacystin，可以引起黑质多巴胺能神经元的损伤。4．LacZ-BMSCs和GDNF-BMSCs纹状体移植能减轻Lactacystin所致黑质多巴胺能神经元的损伤，GDNF-BMSCs疗效优于LacZ-BMSCs组。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 GDNF慢病毒表达载体的构建及病毒的生产
• 材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 慢病毒介导的GDNF在BMSCs中的表达及其对Lactacystin引起PC12细胞毒性的保护作用
• 材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 基因工程细胞移植治疗偏侧lactacystin-帕金森大鼠模型
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文小结
• 综述
• 致谢
• 发表论文