JAK/STAT信号通路在谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡中的作用

论文摘要

近年的研究表明，脑缺血、脑出血、癫痫、脑外伤、缺氧性脑病，神经系统变性及退行性变等神经系统疾病均具有某些相似或共同的生理病理机制，均存在细胞坏死和凋亡。有效的干预神经细胞凋亡进程是当今神经病学研究的重点，也将是今后治疗的重点。中枢系统的许多疾病的发病机制与谷氨酸（Glu）的内源性兴奋性毒性作用有关，兴奋性氨基酸的毒性作用能诱导神经细胞凋亡。钙离子大量内流，活性氧（ROS）生成增多，水肿，乙酰胆碱受体，腺苷受体A1，神经肽Y受体等均参与了Glu释放的调节，这些因素可直接损伤细胞膜，破坏所有膜结构，造成一系列细胞的功能紊乱。Glu释放涉及多个环节和多种机制，因此抑制Glu释放可以对抗脑损伤时引起的神经元损伤。JAK／STAT信号转导通路是一条应激反应通路，广泛参与细胞的增殖、分化成熟、凋亡以及免疫调节等过程，是众多细胞因子信号转导的重要途径之一。在不同的疾病中所起的作用不一致，那么，在神经细胞凋亡或坏死时是否可以上调和活化JAK、STAT蛋白以及JAK／STAT的激活作用是什么?本文展开了以下的研究工作。第一部分谷氨酸诱导的PCI2细胞凋亡模型确立研究目的：探讨谷氨酸诱导PC12细胞凋亡的浓度及作用时间研究方法：1．PI染色流式细胞仪（FCM）检测PC12凋亡2．Hochest染色检测PC12细胞凋亡研究结果：1．谷氨酸引起PC12细胞50％左右凋亡浓度的确定：用100-2000umol／L的谷氨酸处理PC12细胞，引起PC12细胞的凋亡具有剂量依赖性的关系。不同剂量的谷氨酸处理20min的结果显示：100、200、300umol／L谷氨酸作用20min，凋亡率分别为（3.20±0.37）％、（4.50±0.29）％、（4.50±0.88）％，与正常组对照没有引起PC12细胞明显的凋亡（P＞0.05）；500umol／L谷氨酸作用20min，凋亡率增加到（61.20±4.60）％、与正常组PC12细胞凋亡率对比有明显的统计学差异（P＜0.01）；1000、2000umol／L的谷氨酸作用20min，凋亡率为（70.81±3.58）％和（86.76±2.28）％。根据实验要求，我们选择500umol／L作为本实验中谷氨酸损伤浓度。2．谷氨酸引起PC12细胞50％左右凋亡时间点的确定为进一步明确500umol／L谷氨酸作用PC12细胞20min诱导凋亡的情况，我们分别选取了不同时间段（5min、10min、20min、30min和60min）来观察不同时间段PC12细胞的凋亡情况，实验结果显示，5min组为（9.70±0.94）％、10min组（44.28±3.79）％、20min组为（61.20±3.89）％、30min组（65.68±3.71）％、60min组（55.01±3.99）％，与对照组比均有统计学差异（P＜0.01），20min、30min组没有统计学差异P＞0.05。根据以上的实验结果，本文选定谷氨酸的损伤浓度为500umol／1、损伤时间为20min，开展以后的工作。1．Hochest染色及PI染色流式细胞仪（FCM）观察细胞凋亡①经Hochest荧光染色后，在荧光显微镜下观察到，对照组PC12细胞染色质分布均匀，为弥漫均匀的低强度荧光；经500umol／L谷氨酸处理20min后PC12细胞呈现典型的凋亡特征：大量的细胞核呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光。②我们通过对凋亡图谱中亚二倍体峰的定量分析发现，经500umol／L谷氨酸作用PC12细胞20min，引起细胞（61.20±4.60）％，对照组PC12细胞的正常凋亡率为：（2.71±0.30）％。以上结果表明，谷氨酸可以诱导PC12细胞的凋亡。结论：500umol／L谷氨酸，作用20min可以诱导PCI2细胞发生50％左右的细胞凋亡。第二部分JAK／STAT信号通路在谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡中的作用研究目的：探讨JAK／STAT途径在谷氨酸处理的细胞损伤中的作用研究方法：1．Western blot定性定量分析各种蛋白被Glu处理激活的情况。2．Hochest染色检测PC12细胞凋亡。3．PI染色流式细胞仪（FCM）检测PC12细胞凋亡。4．MTT检测PC12细胞存活率研究结果：JAK／STAT信号途径介导了谷氨酸处理的神经细胞凋亡①500umol／L的谷氨酸处理PC12细胞20min后，诱导了P-JAK2的快速表达②P-JAK2活性的上调诱导了P-STAT3的活化③在谷氨酸处理前20min给予JAK2的特异性抑制剂AG-490（10umol／L）可以阻断谷氨酸对JAK／STAT通路的激活，不但阻断了P-JAK2的上调，而且阻断了P-STAT3的活化。④在谷氨酸处理前20min给予JAK2的特异性抑制剂AG-490（10umol／L），可以使PC12细胞的凋亡减少，细胞存活率增高。结论：JAK／STAT信号途径促进了了谷氨酸处理的神经细胞凋亡过程。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一:谷氨酸毒性作用与细胞凋亡
• 二:细胞凋亡与神经系统疾病
• 三:JAK/STAT信号通路与脑缺血
• 四:JAK/STAT信号通路与氧化应激
• 五:兴奋性氨基酸毒性作用与氧化应激
• 六:JAK/STAT信号通路和其他系统疾病
• 七:实验设想
• 八:实验思路
• 第一部分 谷氨酸诱导PC12细胞凋亡模型的建立
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 1.5 参考文献
• 第二部分 JAK/STAT信号通路在谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡中的作用
• 2.1 材料和方法
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 2.6 参考文献
• 全文总结
• 附录:缩略词表
• 学习期间已发表的论文
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明